轉(zhuǎn)化醫(yī)學真菌學實例——直接提取DNA鑒定菌種及體外藥敏試驗指導診治面部難辨認癬

康道現(xiàn) 冉玉平 尹斌 代亞玲

(四川大學華西醫(yī)院1.皮膚性病科;2.實驗醫(yī)學科，成都 610041)

面部難辨認癬極易誤診誤治［1-2］。傳統(tǒng)診斷方法主要靠真菌鏡檢及培養(yǎng)等。鏡檢能明確真菌感染但不能鑒定菌種，培養(yǎng)鑒定耗時較長。我們采用皮損處鱗屑直接做分子生物學菌種鑒定，及早明確菌種，待培養(yǎng)菌落長出后做分子生物學鑒定進行驗證，并做體外藥敏實驗指導臨床用藥。

1 臨床資料

患者女，56歲，因面部紅斑、鱗屑就診。6個月前面部出現(xiàn)紅斑，瘙癢伴燒灼感，自用多種外用藥(藥名不詳)無效，皮損面積逐漸擴大，邊界不清，表面覆有鱗屑，有燒灼感。2周前在院外診斷"面部皮炎"，經(jīng)抗過敏治療(具體不詳)無效。查體見面部對稱性大片紅斑，邊界欠清晰，表面大量糠樣鱗屑(見圖1)，觸之粗糙。頸部耳后淋巴結(jié)無腫大，肝、腎功無異常。無其他基礎(chǔ)疾病及系統(tǒng)使用免疫抑制藥物史。

2 實驗室研究

2.1 直接鏡檢

膠帶粘取病變部位鱗屑，加10%KOH后直接鏡下觀察，可見大量有隔菌絲(見圖2)。

2.2 鱗屑標本收集處理和PCR-測序

刮取面部鱗屑 (體積至綠豆大小，約重0.01 g)于1.5 mL離心管中［3-4］，加入自制溶角質(zhì)液 1 mL處理后1 000 r/min離心1 min，棄上清液。加入1 mL無菌蒸餾水充分混勻，1 000 r/min離心1 min，棄上清液，重復洗滌1次。采用Bioflux真菌DNA提取試劑盒 (北京博邁斯生物科技有限公司)提取沉淀DNA，方法參照試劑盒說明書。以真菌rDNA基因保守區(qū)為靶目標，采用真菌通用引物ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)，擴增所提取真菌DNA的ITS區(qū)。反應體系:模板DNA 21 μL，引物各2 μL，2×Pfu PCR寡核苷酸混合物 Master Mix 25 μL。反應條件:94℃ 2 min，94℃ 30 s，47℃ 15 s，72℃ 1 min，共35 個循環(huán)，最后72℃ 10 min;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后Gold View染色驗證，約600 bp(見圖3)。將PCR擴增產(chǎn)物送美吉生物基因公司測序，結(jié)果登錄 GenBank進行Blast比對，與萬博節(jié)皮菌 (趾間毛癬菌有性期)Arthrodermavanbreuseghemii(登錄號EU683894)［5］18 s rDNA 部 分 序 列 堿 基 一 致 性99%、ITS全序列、28 s rDNA部分序列堿基一致性99%(登錄號JF775847)。

2.3 培養(yǎng)及鑒定菌種

將部分鱗屑接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基(SDA)，28℃培養(yǎng)7 d見淡黃色絲狀菌落長出 (見圖4)。挑取少量菌落做鋼圈小培養(yǎng)，鏡下觀察可見大量分隔菌絲和小分生孢子，可見棒狀大分生孢子 (見圖5)［6］。采用Bioflux試劑盒提取培養(yǎng)菌落真菌DNA。以真菌rDNA基因保守區(qū)為靶目標，用真菌通用引物ITS1和ITS4，擴增ITS區(qū)。反應體系:模板 DNA 4 μL，引物各2 μL，2 × Pfu PCR 寡核苷酸混合物Master Mix 25 μL，無菌雙蒸水補足50 μL。反應條件同上。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后Gold View染色驗證，約600 bp。送測序后Blast比對，與萬博節(jié)皮菌 (趾間毛癬菌有性期)Arthrodermavanbreuseghemii(登錄號EU683894)［5］18 s rDNA 部 分 序 列 堿 基 一 致 性99%、ITS全序列、28 s rDNA部分序列堿基一致性99%(登錄號JF736844)，與從鱗屑提取DNA經(jīng)PCR擴增后測序結(jié)果一致。

2.4 體外藥敏試驗

挑取培養(yǎng)菌落溶于無菌蒸餾水后充分混勻，調(diào)濁度至0.5～1麥氏濁度，將菌懸液均勻涂布于SDA培養(yǎng)基平板表面制作含菌平板，在此培養(yǎng)基上等距打3孔，分別注入等量市售成品藥物2%酮康唑乳膏 (金達克寧，西安楊森)、1%特比萘芬乳膏 (蘭美抒，北京諾華)、1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏 (必亮，重慶華邦)，置28℃培養(yǎng)7 d［7］。觀察各藥膏孔周圍抑菌圈大小并記錄其直徑，同時做2個平板，取2個平板實驗結(jié)果的抑菌圈直徑的平均值和標準差。結(jié)果示含上述3種抗真菌乳膏孔周圍的抑菌圈直徑依次分別為(29.5±3.54)mm、(65.00 ±4.24)mm、(78.00 ±5.67)mm(見圖 6)。

3 診斷與治療

根據(jù)患者皮損特點及真菌直接鏡檢結(jié)果，臨床診斷為面部難辨認癬，立即給予口服特比萘芬 (蘭美抒，北京諾華)250 mg/d，外洗2%酮康唑洗劑(采樂，西安楊森)1次/d，外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏(必亮，重慶華邦)1次/d。2周后患者復診依據(jù)抗真菌藥物抑菌實驗結(jié)果繼續(xù)口服特比萘芬及外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏治療，患者每次復診時行真菌直接鏡檢和培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性繼續(xù)治療，總療程5周，鏡檢和培養(yǎng)陰性，鱗屑消失，皮損治愈 (見圖7)。

圖1 初診時患者面部皮損 圖2 KOH直接鏡檢可見大量有隔菌絲(×400) 圖3 上泳道為菌落PCR結(jié)果，下泳道為鱗屑PCR結(jié)果，大小均為600 bp左右 圖4 鱗屑接種于沙堡弱培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d見淡黃色絲狀菌落生長。連續(xù)培養(yǎng)5周，第1、2、3、4周為陽性，第5周轉(zhuǎn)陰 圖5 小培養(yǎng)鏡下見葡萄串狀小分生孢子和棒狀大分生孢子(×400) 圖6 體外藥敏實驗:順時針方向依次為2%酮康唑乳膏、1%特比萘芬乳膏、1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏 圖7 治療5周后皮損(注:圖中紅字顯示所需時間)Fig.1 Facial tinea incognito before treatment Fig.2 A bound of septate hyphea by KOH examination Fig.3 The upper track:PCR of the scales，the lower track:PCR of isolated colonies Fig.4 Colonies on Sabouraud dextrose agar after 7 days at 28℃.The first 4 weeks are positive and the fifth week becomes negative Fig.5 Slide culture:microconidia and cigar-shaped macroconidia(×400)Fig.6 In vitro susceptibility test:2%ketoconazole，1%terbinafine and 1%naftifine-0.25%ketoconazole clock wisely Fig.7 Cured after 5 weeks treatment(The red words show the time needed)

4 討 論

趾間毛癬菌在須癬毛癬菌復合體中最為常見，近來經(jīng)分子系統(tǒng)學分析，其有性期對應為萬博節(jié)皮菌。感染人類時常累及頭皮、破損皮膚和須部等皮膚，可致手足癬、體股癬、頭癬、須癬和甲癬，多為散發(fā)性感染［8］。咪唑類的酮康唑及丙烯胺類的萘替芬、特比萘芬的外用制劑用于治療多種皮膚癬菌及念珠菌感染性皮膚病。與丙烯胺類相比，酮康唑?qū)ζつw癬菌抗菌效果較差，臨床上有病例存在耐藥情況。丙烯胺類對皮膚癬菌效果較好，但對某些念珠菌效果較差［9］。及時準確的鑒定菌種以及藥敏試驗對于指導臨床用藥意義重大。采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法鑒定趾間毛癬菌耗時長，至少需要7～14 d。而采用鱗屑直接提DNA鑒定在48～72 d內(nèi)即可完成。為從鱗屑中直接提取致病真菌DNA，先用溶角質(zhì)液處理，離心去除角質(zhì)溶解物以充分暴露菌體，便于釋放真菌DNA。再以無菌蒸餾水洗滌兩次，排除處理液對提取DNA的干擾。從鱗屑中直接提取的真菌DNA含量較來自純培養(yǎng)菌落的DNA少，PCR時以含DNA的溶液完全替代雙蒸水，從純培養(yǎng)時的4 μL加至21 μL以擴增出能滿足測序所需的產(chǎn)物。

從鱗屑中直接鑒定菌種的非培養(yǎng)法沒有菌株，不能做體外藥敏實驗。因此培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法相結(jié)合，先行非培養(yǎng)法明確致病菌種，待菌落長出后做PCR-測序進行驗證，并做體外藥敏實驗驗證依據(jù)鏡檢陽性的經(jīng)驗性治療是否為最佳組合，為進一步調(diào)整用藥提供依據(jù)。直接從鱗屑提取DNA做分子生物學鑒定與培養(yǎng)菌株提取的DNA做分子生物學鑒定結(jié)果可相互驗證，結(jié)合成品抗真菌藥物的藥敏試驗，既能提早明確致病菌種為經(jīng)驗性治療選藥，又能篩選敏感藥物確定是否需調(diào)整藥物，定期取材培養(yǎng)可確定療程，為何時停藥提供客觀指標。內(nèi)服藥物的體外藥敏實驗并不能完全模擬體內(nèi)過程，有一定局限性，而直接將外用藥物加入打孔的培養(yǎng)基內(nèi)，根據(jù)抑菌圈的大小直接判斷其抗菌活性強弱對臨床有指導意義［7］。

本例患者就診時取鱗屑做鏡檢和培養(yǎng)，并保存部分鱗屑備查。直接鏡檢陽性后立即給予口服特比萘芬和外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏治療。從鱗屑中提取DNA做PCR鑒定為萬博節(jié)皮菌。7 d后培養(yǎng)菌落分子生物學鑒定與鱗屑鑒定結(jié)果一致。取培養(yǎng)菌落做藥敏試驗證實治療方案有效，根據(jù)每周隨訪培養(yǎng)結(jié)果共治療5周后患者痊愈。面部難辨認癬的診斷和治療療程判斷困難，本病例旨在將常用的實驗室技術(shù)整合，用于從臨床到實驗室(取患者鱗屑到實驗室做分子生物學鑒定和藥敏試驗)，實驗室到臨床 (分子生物學鑒定和藥敏實驗結(jié)果指導臨床用藥并監(jiān)測培養(yǎng)確定療程)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學真菌學實踐，達到個體化診療。

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