小鼠煙曲霉角膜炎的實驗研究

吳然 程波 賈敏

(1.貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴陽 550001;2.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，福州 350001)

煙曲霉作為真菌性角膜炎的主要致病菌種之一［1］，其致盲率高，本實驗初步探討了伊曲康唑?qū)熐沟捏w外和體內(nèi)抗真菌活性，以期促進曲霉病的臨床研究。

1 材料和方法

1.1實驗材料

菌株及動物 煙曲霉取自我院真菌實驗室保存菌種。清潔級昆明小白鼠 (ICR)6～8周齡，體重(30±0.5)g，雌雄兼用，福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，無眼疾。

主要試劑及配制方法馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)按中華人民和國國家標準，微生物學檢測方法 GB/T14926.43-2001 4.16 和 4.17 方法進行配制［2］。伊曲康唑口服液，比利時楊森制藥公司;氟康唑注射液，魯南制藥股份有限公司。

儀器設(shè)備 奧林巴斯光學顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、血球計數(shù)板、結(jié)膜注射針等。

1.2 方法

建立實驗小鼠模型 煙曲霉分生孢子懸液的制備:收集PDA培養(yǎng)平皿蓋內(nèi)完全純化的煙曲霉孢子，用生理鹽水稀釋成孢子混懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子混懸液調(diào)配成106CFU/mL備用。

接種煙曲霉孢子懸液:隨機選取30只正常小鼠，予10%水合氯醛麻醉腹腔注射麻醉后，在手術(shù)顯微鏡指導下，用結(jié)膜注射針在小鼠角膜中央1/3～1/2基質(zhì)層，注入煙曲霉孢子懸液10 μL(含106CFU煙曲霉孢子)，閉合小鼠瞼裂并適當搓揉使菌液充分黏附于角膜組織中。模型建立后，在不同時間對病變角膜行臨床評分﹑真菌鏡檢、培養(yǎng)。

模型小鼠角膜病灶臨床評分:自接種24 h起，每天將小鼠麻醉后在手術(shù)顯微鏡觀察角膜病變，并予臨床評分。評分標準參照Wu TG等［3］的方法:按小鼠角膜混濁面積、深度及角膜表面平整光滑度分別給予評分，3項的分數(shù)相加為該眼的總分，根據(jù)此法，正常未受外傷的角膜總評為0分;總分≤5為輕度、6～9分為中度、≥10分為重度。

模型小鼠角膜分泌物真菌鏡檢、培養(yǎng):接種后第5天，將小鼠麻醉后，用無菌鈍性刀片刮取適量病變角膜表面分泌物，置于無菌載玻片上，滴1～2滴10%KOH，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察有無菌絲及孢子，同時取盡可能多的分泌物按點植法接種在SDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中進行培養(yǎng)。

藥敏試驗 采用藥基法［4］檢測伊曲康唑和氟康唑?qū)熐沟目咕钚浴?/p>

制備含藥液的培養(yǎng)基:將SDA培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后，冷卻至45℃，用此液化的SDA分別將伊曲康唑和氟康唑倍比稀釋成(200～0.1)μg/mL12個濃度梯度 (見表1)。0號管為無藥SDA，作為陽性對照。

表1 含不同藥物濃度(μg/mL)的沙氏培養(yǎng)基(SDA)Tab.1 SDA with different drug concentration

在含藥培養(yǎng)基中接種煙曲霉孢子混懸液:取50 μL(濃度為106CFU/mL)煙曲霉孢子懸液，劃線接種于上述已固化的斜面培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)，48 h后檢查。此試驗在同樣條件下重復做3次，觀察結(jié)果。

判讀伊曲康唑和氟康唑?qū)熐沟淖畹鸵志鷿舛?MIC):上述培養(yǎng)基外觀清晰無菌落生長判讀為陰性，其中藥物濃度最低者，即為伊曲康唑?qū)熐规咦拥腗IC。

檢測伊曲康唑和氟康唑?qū)熐沟淖畹蜌⒕鷿舛?MFC):刮取上述MIC試驗中全部陰性試管中培養(yǎng)基表面的接種物，采用點植法接種于新鮮配制的無藥SDA培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果，無菌落生長即為陰性，接種物中所含藥物濃度最低者，即為伊曲康唑?qū)熐规咦拥腗FC。

實驗動物治療 在已接種成功模型小鼠中選臨床評分為6～9分者，隨機分成4組。每組6只，第1組予等毫升數(shù)的生理鹽水作對照治療，第2、3、4 組分別按 25 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1、75 mg·kg-1·d-1劑量予伊曲康唑灌胃治療。第2組灌胃1次/d，第3、4組分2次灌胃，共治療兩周。每日用手術(shù)顯微鏡觀察病情變化。

療效評價:治療結(jié)束，對治療組和對照組全部行臨床評分后，于頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘取病變角膜，沿病變處將角膜平均切成兩半，每組隨機選取一半作病理檢查，并作炎性評分;取另一半病變角膜，按菌落總數(shù)平板測定法［5］，計測比較各治療組和對照組的CFU。炎性評分標準參考Vemuganti［6］等的半定量方法，將角膜病變分為輕度(1分)、中度 (2分)、重度 (3分)。

1.3 統(tǒng)計學方法

療效評價時計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間差異性采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK檢驗，檢驗有效水準為α=0.05，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理以上數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 建立實驗小鼠模型結(jié)果

30只小鼠其中有3只在接種后5 d內(nèi)死亡，其余小鼠角膜呈現(xiàn)典型煙曲霉性角膜潰瘍，表現(xiàn)有菌絲苔被及偽足(見圖1)。接種后第5天，取角膜潰瘍處分泌物行10%KOH濕片檢查，發(fā)現(xiàn)透明有隔呈45°分支的菌絲，同時見有散在的孢子 (見圖2)。模型小鼠角膜組織真菌培養(yǎng)結(jié)果光鏡下見典型煙曲霉結(jié)構(gòu) (見圖3)，證實眼部感染的病原體即為接種的煙曲霉菌株。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

伊曲康唑?qū)熐沟?MIC為 6.25 μg/mL，MFC為12.5 μg/mL;氟康唑?qū)熐沟?MIC為500 μg/mL，MFC 為 1 000 μg/mL。

2.3 治療結(jié)果及療效評價

治療結(jié)束，治療2周后實驗組小鼠角膜混濁面積明顯減少 (見圖4);組織病理學檢查顯示角膜上皮恢復完整，纖維層排列致密，炎癥細胞及新生血管較少(見圖5);其菌落總數(shù)平板測定結(jié)果顯示，菌落計數(shù)與所用藥物劑量成反比，高劑量治療組平均菌落數(shù)為2個 (見圖6)。對照組(見圖7)予生理鹽水沖洗2周后病變角膜無明顯好轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)明顯混濁(見圖8);組織病理學檢查顯示角膜上皮層厚薄不一，基質(zhì)纖維排列疏松紊亂，間有較多新生血管及炎癥細胞 (見圖9)，其平均菌CFU為100±6.56個(見圖10)。對相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及SNK檢驗，結(jié)果顯示治療組 (治療劑量由低到高分別為2、3、4組)在臨床及炎性評分和菌落計數(shù)均明顯低于對照組 (P＜0.05);治療組間顯示各評分結(jié)果與治療劑量相關(guān):藥物劑量高的其評分及菌落計數(shù)均顯著低于劑量低者 (P＜0.05)(見表2及圖11～12)。

表2治療組于對照組各測評指標(±s)及差異分析(采用SNK檢驗P＜0.05)Tab.2 Test indexs between treatment and control groups

表2治療組于對照組各測評指標(±s)及差異分析(采用SNK檢驗P＜0.05)Tab.2 Test indexs between treatment and control groups

組別測評指標1 2 F P 3 4臨床評分 3.39 ±0.13 3.07 ±0.13 2.68 ±0.15 2.53 ±0.13 49.29 ＜0.05炎癥評分 1.75±0.09 1.57±0.09 1.13±0.10 1.02±0.04 98.65 ＜0.05 CFU(個) 100.02 ±6.56 30.02 ±5.52 10.02 ±5.10 6.50 ±5.26 350.25 ＜0.05

3 討 論

曲霉性角膜炎對患者的視功能造成直接損傷，醫(yī)藥界一直在積極尋求廣譜、高效、低毒、且對角膜組織滲透性強的抗曲霉藥，以氟康唑和伊曲康唑為代表的三唑類抗真菌藥，通過抑制真菌細胞色素P450去甲基酶，使真菌細胞膜上的麥角固醇合成受阻，中間代謝產(chǎn)物甲基戊酸堆積，造成真菌細胞膜的完整性和活性喪失而起到抑制真菌生長的作用。藥物結(jié)構(gòu)中的三唑環(huán)對真菌色素P450保持較強的親和力，而對人細胞色素P450親和力很低，從而保證了藥物的低毒性［7］。伊曲康唑抗菌譜廣，實驗和臨床研究證實對曲霉有效。氟康唑抗菌譜相對較窄，主要用于部分念珠菌，隱球菌所致的感染，對曲霉等活性較低，且易產(chǎn)生耐藥性［8］。本實驗采用藥基法，比較了伊曲康唑和氟康唑?qū)熐沟捏w外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑?qū)熐沟腗IC(6.25 μg/mL)明顯低于氟康唑?qū)熐沟腗IC(500 μg/mL)，據(jù)此我們選擇抗菌活性較高的伊曲康唑作為治療藥物。治療兩周后評價療效，治療組較對照組病情明顯改善，其臨床評分、炎性評分及菌落計數(shù)均明顯低于對照組，證實伊曲康唑?qū)嶒炐詿熐菇悄ぱ子忻鞔_的療效。本實驗發(fā)現(xiàn)感染后第4天有12.5%角膜穿孔，第7 d見菌絲和孢子向眼內(nèi)侵襲，這種現(xiàn)象說明煙曲霉引起的角膜損傷，病情發(fā)展迅速，易致曲霉眼內(nèi)感染，提示早期治療的必要性。本實驗病理學檢查顯示，感染后36 h角膜基質(zhì)層有新生血管長出，此時角膜上皮仍呈現(xiàn)大量缺損，推測此時抗真菌治療將利于藥物對組織的滲透，這為強調(diào)早期抗真菌治療提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。曲霉性角膜炎宜及早治療，伊曲康唑?qū)υ缙谇剐越悄ぱ庄熜Т_切。

圖1 治療組:接種24 h后小鼠角膜像 圖2 模型小鼠角膜真菌鏡檢圖像(×400) 圖3 小鼠角膜真菌培養(yǎng)鏡下結(jié)構(gòu)(×1 000)圖4治療組治療14 d后小鼠角膜像 圖5 治療組治療后第14天小鼠角膜組織像(HE，×400) 圖6 治療組治療后第14天菌落計數(shù) 圖7對照組:接種后24 h 圖8 對照組:接種后第14天小鼠角膜像 圖9 對照組:接種后14 d小鼠角膜組織像 圖10 對照組接種后第14天菌落計數(shù) 圖11 接種后第14天，對照組和治療組的臨床評分和炎性評分 圖12 接種后第14天，對照組和治療組的菌落計數(shù)(1為生理鹽水對照組，2為25 mg·kg-1·d-1劑量治療組，3為50 mg·kg-1·d-1劑量治療組，4為75 mg·kg-1·d-1劑量治療組)Fig.1 Corneal appearance of treated mouse 24 hs after after inoculation Fig.2 Direct light microscopy of infected cornea(×400) Fig.3Fungus isolated from mouse cornea under light microscope(×1 000) Fig.4 Corneal appearance after 14 d treatment Fig.5 Cornea under microscope after 14 d treatment(HE，×400)Fig.6 Mold colony counting after 14 d treatment Fig.7 Cornea of the control mouse 24 hs after inoculation Fig.8 Cornea of the control mouse 14 ds after inoculation Fig.9 Cornea of control mouse 14 ds after inoculation Fig.10 Mold colony counting from the control group 14 ds after inoculation Fig.11 Clinical evaluation and infilammation grades between control and treatment groups 14 ds after inoculation Fig.12 Mold colony counting between control and treatment groups 14 ds after inoculation

本實驗組織學檢查結(jié)果顯示大量炎癥細胞參與了對組織的降解破壞，由此提示在真菌性角膜炎的發(fā)展和愈合過程中，在有效抗真菌治療基礎(chǔ)上，加用適量糖皮質(zhì)激素類抗炎藥，將有利于減輕炎癥反應，改善愈后，其具體用藥方法及實際應用價值有待進一步研究。

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