鹽酸特比萘芬包合物脂質(zhì)體的制備*

閆夢茹，羅國平，張文博，王小寧，陳 程

（1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021；2.浙江溫州輕工研究院，浙江 溫州325003；

3.陜西科技大學(xué) 陜西省輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安710021）

鹽酸特比萘芬作為一種抗真菌藥，具有療效佳，毒性低等優(yōu)點。既可口服也可外用[1]。在外用時，可滲透到達角質(zhì)層，與皮膚角質(zhì)層細胞緊密結(jié)合發(fā)揮藥效[2]，而對于深部真菌性皮膚感染疾病，則需采用口服與外用制劑聯(lián)用治療。由于鹽酸特比萘芬水溶性較差，體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運困難，口服不良反應(yīng)嚴重[3]。所以尋找一種能將鹽酸特比萘芬送到皮膚深層并能起到長效緩釋作用的給藥系統(tǒng)迫在眉睫。

包合技術(shù)是利用主分子較大空穴將客分子包嵌，從而形成分子膠囊包合物的技術(shù)，可提高難溶性藥物的溶解度和穩(wěn)定性[4]。羥丙基-β-環(huán)糊精（HPβ-CD）是一種常用的包合材料，具有中空圓筒狀結(jié)構(gòu)，圓筒內(nèi)疏水，圓筒外親水。以HP-β-CD為包合輔料，將鹽酸特比萘芬包合在HP-β-CD的圓筒結(jié)構(gòu)內(nèi)，有效的提高其在水中溶解性，改善其生物利用度。

脂質(zhì)體是由膽固醇和磷脂組成的具有高生物相容性的載藥系統(tǒng)，因在結(jié)構(gòu)中含有疏水體膜和親水內(nèi)核，可同時載親水及親脂成分[5-7]，故分別將親水性成分鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物包裹于脂質(zhì)體內(nèi)水相中，將親脂性成分鹽酸特比萘芬包裹于磷脂雙分子層中。磷脂雙分子層中的鹽酸特比萘芬最先釋放，內(nèi)水相中的包合物作為藥庫，緩慢釋放藥物，從而達到長效緩釋的作用，本文將對鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的制備工藝進行研究。

1 實驗部分

1.1 試藥

鹽酸特比萘芬對照品（生產(chǎn)批號170105武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司）；膽固醇（生化劑 東巨榮生物工程有限公司）；吐溫-80（CP天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇、1,2-丙二醇、NaH2PO4、Na2HPO4、冰乙酸均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三乙醇胺（AR天津市富宇精細化工有限公司）；甲醇、三乙胺（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Agilent Tech.1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；TG-1650-WS型臺式高速離心機，SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT125D型電子天平（賽多斯科學(xué)儀器(北京)有限公司）

1.3 篩選鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物的制備工藝

1.3.1 鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物的制備方法 在室溫條件下，稱取13g HP-β-CD，加到40mL的純化水中制備量HP-β-CD飽和溶液。再向HPβ-CD飽和液中緩慢滴加鹽酸特比萘芬乙醇溶液，邊加邊超聲，超聲一定時間后冷凍干燥。最后加石油醚多次洗滌干燥物并快速抽濾，烘干，即得到白色粉末狀包合物。

1.3.2 單因素實驗

（1）主客分子比對包合率的影響 分別選取鹽酸特比萘芬與HP-β-CD質(zhì)量比為1∶10、1∶13、1∶15、1∶20，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HPβ-CD包合物并測定包合率。

（2）超聲時間對包合率的影響 分別選取超聲時間20、30、40min，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物并測定包合率。

（3）超聲溫度對包合率的影響 分別選取超聲溫度30、40、50、60℃，其它條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物并測定包合率。

1.4 優(yōu)化鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的制備工藝

1.4.1 乙醇注入法制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體 精密稱取一定量的卵磷脂、膽固醇置于燒杯中，加入一定量無水乙醇，超聲溶解，加入鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物，在30℃、20r·min-1條件下，用注射器緩慢注入一定量磷酸鹽緩沖液（PBS），并繼續(xù)攪拌25min，超聲2min，冷卻至室溫，即得到鹽酸特比萘芬包合物脂質(zhì)體，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 單因素考察

（1）藥脂比對包封率的影響 分別選取主藥與卵磷脂的比例為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體并測定包封率。

（2）卵磷脂與膽固醇的比例對包封率的影響 分別選取膽固醇與卵磷脂的比例為1∶1、1∶3、1∶5、1∶6，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體并測定包封率。

（3）超聲時間對包封率的影響 稱取主藥0.03g，膽固醇0.04g，卵磷脂0.12g，超聲時間分別選取2，4，6，8min，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體并測定包封率。

（4）攪拌時間對包封率的影響 稱取主藥0.03g，膽固醇0.04g，卵磷脂0.12g，攪拌時間分別選取5，15，25，35，45min，其他條件不變，分別制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體并測定包封率。

（5）醇相含量對包封率的影響 稱取主藥0.03g，膽固醇0.04g，卵磷脂0.12g，分別取醇相含量為30%、40%、50%其他條件不變，制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體并測定包封率。

1.4.3 正交試驗優(yōu)化處方 由上述單因素的實驗結(jié)果可知，對鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體包封率影響較大的因素有3個，即藥脂比（A）、膽固醇與磷脂的比例（B）、攪拌時間（C）。故正交試驗將以包封率為評價指標，選用L9（34）正交試驗，對這3個因素進行考察，具體實驗分組見表1。

表1 正交試驗表Tab.1 Table of orthogonal test

1.5 HPLC法測定鹽酸特比萘芬含量方法學(xué)考察[8,9]

1.5.1 溶液的配制

（1）對照品溶液的配制 精密稱取鹽酸特比萘芬對照品6mg，置25mL容量瓶中，用甲醇20mL超聲溶解，并定容至刻度，搖勻即得（濃度：0.24mg·mL-1）。

（2）供試品溶液的配制 取鹽酸特比萘芬HPβ-CD包合物脂質(zhì)體溶液5mL，3000r·min-1離心20min，取上清液置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得。

（3）空白溶液的配制 制備不加鹽酸特比萘芬的HP-β-CD包合物脂質(zhì)體，照“1.5.1（2）”項下方法操作。

1.5.2 色譜條件的建立 色譜柱：Agilent 5 TC-C18250×4.6mm，流動相：甲醇-水-三乙胺溶液（0.1%三乙胺溶液，用HAc調(diào)pH值至7.5）（95∶1∶4），檢測波長：282nm，流速：1.0mL·min-1，柱溫：20℃，進樣量：20μL。

1.5.3 專屬性實驗 分別取對照品、供試品、空白溶液各1mL，過0.45μm微孔濾膜，并進樣20μL，按照“1.5.2”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖（圖9）。

1.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.5.1（1）”項下鹽酸特比萘芬對照品溶液0.2、0.6、1、2、5mL，置5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得不同濃度的溶液，各取1mL過0.45μm微孔濾膜，并進樣20μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸。

1.5.5 精密度試驗 吸取“1.5.1（1）”項下鹽酸特比萘芬對照品溶液1mL，過0.45μm微孔濾膜，并精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，按“1.5.2”項下的色譜條件進行測定，并連續(xù)進樣6次，計算RSD值。

1.5.6 重復(fù)性試驗 照“1.4”項下制備脂質(zhì)體的方法平行制備樣品溶液6組，并按照“1.5.1（2）”項下處理樣品，吸取鹽酸特比萘芬供試品溶液各1mL，過0.45μm微孔濾膜，并精密吸取20μL樣品通過“1.5.2”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖中峰面積并計算RSD值。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗 將同一組鹽酸特比萘芬供試品溶液放置在常溫環(huán)境中，分別在0、1、2、4及6h取1mL，過0.45μm微孔濾膜，并精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，按“1.5.2”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖中鹽酸特比萘芬峰面積，根據(jù)峰面積計算RSD。

1.5.8 加樣回收試驗 分別取已知含量的鹽酸特比萘芬供試品溶液9份，再加入其所含鹽酸特比萘芬含量的80%、100%、120%的對照品，按“1.5.2”項下的色譜條件進行測定，并分別計算加樣回收率和RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物的單因素實驗結(jié)果

（1）主客分子比對包合率的影響 如圖1所示，隨著主客分子比例的增加，包合率先逐漸增大再緩慢降低，當(dāng)HP-β-CD與鹽酸特比萘芬比例達到13∶1時，包合率達到最大。包和率沒有隨HP-β-CD的增加一直增加，可能是因為當(dāng)HP-β-CD在溶液中達到一定濃度會發(fā)生分子間的相互作用，且趨勢會不斷加強，從而影響了鹽酸特比萘芬分子進一步進入HP-β-CD的分子腔，因此，鹽酸特比萘芬的包合率不會持續(xù)增加[10]。

圖1 主客分子對包合率的影響Fig.1 Effect of host and guest molecules on inclusion rate

（2）超聲時間對包合率的影響 如圖2所示，隨著超聲時間的增加，包合物的包合率先增加后逐漸降低，當(dāng)超聲時間達到30min時，包封率最大。

圖2 超聲時間對包合率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on inclusion rate

（3）超聲溫度對包合率的影響 如圖3所示，隨溫度上升，鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物包合率先增加后降低，當(dāng)包合溫度達到40℃時，包合率最大。

圖3 超聲溫度對包合率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on inclusion rate

2.2 鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的單因素考察

（1）藥脂比對包封率的影響 如圖4所示，當(dāng)卵磷脂的用量逐漸增大時，包封率明顯增加，但當(dāng)卵磷脂大于鹽酸特比萘芬6倍時，包封率又減小，包封率在藥脂比達到1∶6時最大。

圖4 藥脂比對包封率的影響Fig.4 Effect of drug-to-lipid ratio on encapsulation efficiency

（2）卵磷脂與膽固醇的比例對包封率的影響 如圖5所示，當(dāng)卵磷脂的用量逐漸增大時，包封率明顯減小，包封率在膽固醇與卵磷脂比例達到1∶1時最大。

圖5 膽固醇與卵磷脂的比例對包封率的影響Fig.5 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on the encapsulation efficiency

（3）超聲時間對包封率的影響 如圖6所示，隨著超聲時間逐漸增加，包封率變化并不明顯，由此可見，超聲時間對包封率基本沒影響。

圖6 超聲時間對包封率的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on encapsulation rate

（4）攪拌時間對包封率的影響 如圖7所示，包封率隨攪拌時間的增加先增加后減小，當(dāng)攪拌時間在25min時，包封率最大。當(dāng)攪拌時間超過25min包封率減小，可能是因為攪拌時間過長，破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。

圖7 攪拌時間對包封率的影響Fig.7 Effect of mixing time on encapsulation rate

（5）醇相含量對包封率的影響 如圖8所示，隨著醇相含量的逐漸增加，包封率逐漸減小，但影響并不大。

圖8 醇相含量對包封率的影響Fig.8 Influence of alcohol content on encapsulation efficiency

2.3 正交試驗優(yōu)化處方

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

由表2可知，對鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的包封率的影響因素大小排序為：A＞C＞B，即藥脂比＞攪拌時間＞膽固醇與磷脂比；最佳搭配為A2B2C2，即囊材主藥比（卵磷脂∶膽固醇∶主藥）為6∶2∶1，攪拌時間為25min。

表3 方差分析Tab.3 Results of variance analysis

由表3中的方差分析可知，在a=0.05條件下，這3個因素?zé)o顯著性差異。

2.4 HPLC法測定鹽酸特比萘芬含量方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 對照品、供試品、空白溶液的色譜圖如圖9所示，表明輔料對主藥的測定無干擾，方法專屬性良好。

圖9 色譜圖Fig.9 Chromatograms

2.4.2 線性關(guān)系考察 以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標的線性方程為Y=14900X+16.324，R2=0.9997，說明鹽酸特比萘芬在0.0096～0.24mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 連續(xù)進樣6次峰面積的RSD值為2.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 平行制備6組樣品的峰面積的RSD值為2.6%（n=6），表明本測定方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 鹽酸特比萘芬溶液在0、1、2、4及6h的峰面積的RSD值為3.19%（n=5），表明鹽酸特比萘芬供試品溶液中藥物在6h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 平均加樣回收率為95.7%，RSD為1.92（n=9）。

3 結(jié)論

通過單因素實驗篩選出鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物的工藝條件為主客分子比為1∶13，超聲時間為30min，超聲溫度為40℃；再通過考察單因素結(jié)合正交試驗得到制備鹽酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的最優(yōu)制備條件是磷脂-膽固醇-主藥比為6∶2∶1，醇相含量30%，超聲時間4min，攪拌時間25min。

將鹽酸特比萘芬制成包合物脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，不僅可以增加鹽酸特比萘芬載藥量、提高藥物作用濃度，還能加大鹽酸特比萘芬透皮深度、增大表皮真皮層內(nèi)藥物的滯留量，使得藥物副作用小，作用持久且療效佳。這種將包合技術(shù)和脂質(zhì)體載藥透皮技術(shù)結(jié)合起來的新型藥物載體，為皮膚外用給藥提供一種新劑型，對皮膚病防治具有重要的意義。