當(dāng)歸補(bǔ)血湯對大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究

李志軍

(河南省南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽473061)

當(dāng)歸補(bǔ)血湯源于金代李杲《內(nèi)外傷辨惑論·暑傷胃氣論》，由黃芪、當(dāng)歸以5∶1的比例組成，主要治療氣弱血虛、勞倦內(nèi)傷、陽浮外越的發(fā)熱等。近年來發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心腦血管等作用，從而用于治療血液系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病及腫瘤等。

1 材料與試劑

藥物與試劑:2，4，5－三苯基四氮唑(TTC)染色劑(上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號20060502)，水合氯醛(上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號20090615)，多聚甲醛(上海溶劑廠產(chǎn)品，批號990731)，黃芪、當(dāng)歸等藥材購于隆泰大藥房，經(jīng)南陽醫(yī)專方家選教授鑒定均為藥典品種。

動物:Wistar大鼠，SPF級，體質(zhì)量200～250g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(豫)2007－0004。

儀器:病理圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)產(chǎn)品)，低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品)，BS124S型電子天平(美國賽多利斯公司)，超濾裝置(海寧豐源科技有限公司產(chǎn)品)，聚砜超濾膜(海寧豐源科技有限公司產(chǎn)品)。

2 實驗方法

處方提取液的制備:按處方比例稱取藥材2.0kg，回流提取2次，每次加水10倍量，每次提取1.5h，提取液濃縮至16L，3000r/min離心10min，所得上清液取10000mL備用，其余濃縮成濃度為1.0kg(生藥)/L的提取液。

超濾液的制備:取處方提取液10L用0.45μm的微孔濾膜過濾，再用分子截留量為10萬的超濾膜，在40℃、0.10MPa壓強(qiáng)下超濾，超濾液濃縮成濃度為1.0kg(生藥)/L的提取液。

尼龍栓子的制備:將一長50mm、直徑0.24mm的尼龍線的一端加熱熔成光滑的球形，并在距球端18.0mm處標(biāo)記，酒精擦拭［1］。

大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備:用10%水合氯醛溶液(350mg/kg，ip)麻醉，參照 Longa 等［2］的方法制備大腦中動脈阻斷(MCAO)模型，將尼龍線經(jīng)頸外動脈(ECA)主干切口緩慢向頸內(nèi)動脈(ICA)入顱方向推進(jìn)，以頸總動脈(CCA)分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20mm，感到輕微阻力時即達(dá)到較細(xì)大腦前動脈(ACA)，阻斷大腦中動脈(MCA)的所有血液供應(yīng)。2h后拔出尼龍線，扎進(jìn)動脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離出CCA，ECA和ICA，不閉塞MCA。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫為23～25℃。

分組及給藥:Wistar大鼠64只，分為4組，每組16只。假手術(shù)組用NS等容量，模型組用NS等容量，當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液組用10.0g/kg，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾液組用10.0g/kg，分2次灌胃，連續(xù)灌胃2周，于末次給藥3天后造模，待手術(shù)結(jié)束蘇醒后再給藥1次，給藥量10g/kg。

3 實驗指標(biāo)

大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分:再灌注24h，按Longa法［2］對動物的神經(jīng)功能行為進(jìn)行評分。0分為未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀，1分為不能完全伸展手術(shù)對側(cè)前爪(輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷)，2分為向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺陷)，3分為向手術(shù)對側(cè)傾倒(重度神經(jīng)功能缺陷)，4分為不能自發(fā)行走，意識昏迷。

腦含水量測定［3］:動物處死后，取出大腦稱濕重后將腦組織置于115℃電熱干燥箱中烘至恒重，再稱質(zhì)量，按干濕質(zhì)量法求出腦組織含水量。含水量(%)=［(濕重－干重)/濕重］×100%，腦指數(shù)=(腦濕重/體重)×100。

腦梗死范圍測定［4］:再灌注24h，斷頭取腦，將腦置冰浴生理鹽水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水沖洗大腦使表面不留血污，吸干周圍水分后，沿冠狀切4刀，切成5片。然后迅速將腦片置5mL含有1%TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30min，每隔7～8min翻動1次。經(jīng)染色后正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦片照相，剪下紅白顏色區(qū)稱重計算。然后根據(jù)重量求面積法分別計算出5個腦片共10個平面的總面積和梗死區(qū)域的面積，求出梗死區(qū)面積占半球總面積的百分比，即梗死率。梗死率=［白區(qū)質(zhì)量/(白區(qū)質(zhì)量+紅區(qū)質(zhì)量)］×100%。

采用SPASS11.5軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

4 實驗結(jié)果

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)評分、腦梗死率、腦含水量和腦指數(shù)的影響見表1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對腦缺血再灌注大鼠各項指標(biāo)的影響(±s)

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對腦缺血再灌注大鼠各項指標(biāo)的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

腦指數(shù)假手術(shù)組 16 － 0.00±0.00 0.00±0.00 74.79±2.11 0.45±0.04組別 n 劑量g/kg 行為學(xué)評分 梗死率 腦含水量(%)模型組 16 － 7.37±0.98△△25.74±0.19△△ 79.28±0.95△ 0.52±0.12△當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液組 16 10.0 3.14±0.57△△11.71±0.62△△ 76.29±2.84△ 0.51±0.03△當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾液組 16 10.0 3.36±0.16△ 12.61±0.77△ 77.16±2.32△ 0.49±0.07△

5 討論

中藥制藥過程一般包括提取、分離、濃縮、干燥和制劑等環(huán)節(jié)。其中，提取單元是中藥制藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，影響著最終藥物制劑的質(zhì)量和成本以及制藥業(yè)的現(xiàn)代化水平。由于中藥復(fù)方的臨床療效是多成分多靶點整體作用的結(jié)果，因此無論活性成分的含量還是它們之間的比例變化均會影響處方的療效，但目前在中藥復(fù)方純化工藝的篩選時多選用某一種或一類化學(xué)成分來評價工藝的優(yōu)劣，由于評價指標(biāo)代表性差而使優(yōu)選所得工藝不能保證療效。

觀察表明，提取液組和超濾液組的梗死率、行為學(xué)評分、腦含水量和腦指數(shù)沒有組間差異，可見減少超濾液的服用劑量未對療效造成顯著影響，可用于當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液的純化過程。

［1］Kawamura S，Shirasawa M，F(xiàn)ukasawa H.Attenuated neuropatho1ogy by nivadipine after midd1e cerebra1 artery occ1usion in rats［J］.Stroke，1991，22:51 － 53.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Car1son S，et a1.Reversib1e midd1e cerebra1 artery occ1usion wi1hout craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 － 91.

［3］Young W，Rappaport Z H，Cha1if D J，et a1.Regiona1 brain sodium，potassium and water changes in the rat midd1e cerebra1 artery occ1usion mode1 of ischemia［J］.Stroke，1987，18(4):751－759.

［4］羅勇，董為偉.Wistar大鼠插線法局灶性腦缺血－再灌注模型的實驗研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，27(1):1－4.