當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究

李志軍

(河南省南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽(yáng)473061)

當(dāng)歸補(bǔ)血湯源于金代李杲《內(nèi)外傷辨惑論·暑傷胃氣論》，由黃芪、當(dāng)歸以5∶1的比例組成，主要治療氣弱血虛、勞倦內(nèi)傷、陽(yáng)浮外越的發(fā)熱等。近年來發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心腦血管等作用，從而用于治療血液系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病及腫瘤等。

1 材料與試劑

藥物與試劑:2，4，5－三苯基四氮唑(TTC)染色劑(上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號(hào)20060502)，水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號(hào)20090615)，多聚甲醛(上海溶劑廠產(chǎn)品，批號(hào)990731)，黃芪、當(dāng)歸等藥材購(gòu)于隆泰大藥房，經(jīng)南陽(yáng)醫(yī)專方家選教授鑒定均為藥典品種。

動(dòng)物:Wistar大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(豫)2007－0004。

儀器:病理圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)產(chǎn)品)，低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品)，BS124S型電子天平(美國(guó)賽多利斯公司)，超濾裝置(海寧豐源科技有限公司產(chǎn)品)，聚砜超濾膜(海寧豐源科技有限公司產(chǎn)品)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

處方提取液的制備:按處方比例稱取藥材2.0kg，回流提取2次，每次加水10倍量，每次提取1.5h，提取液濃縮至16L，3000r/min離心10min，所得上清液取10000mL備用，其余濃縮成濃度為1.0kg(生藥)/L的提取液。

超濾液的制備:取處方提取液10L用0.45μm的微孔濾膜過濾，再用分子截留量為10萬(wàn)的超濾膜，在40℃、0.10MPa壓強(qiáng)下超濾，超濾液濃縮成濃度為1.0kg(生藥)/L的提取液。

尼龍栓子的制備:將一長(zhǎng)50mm、直徑0.24mm的尼龍線的一端加熱熔成光滑的球形，并在距球端18.0mm處標(biāo)記，酒精擦拭［1］。

大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備:用10%水合氯醛溶液(350mg/kg，ip)麻醉，參照 Longa 等［2］的方法制備大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型，將尼龍線經(jīng)頸外動(dòng)脈(ECA)主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈(CCA)分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20mm，感到輕微阻力時(shí)即達(dá)到較細(xì)大腦前動(dòng)脈(ACA)，阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)的所有血液供應(yīng)。2h后拔出尼龍線，扎進(jìn)動(dòng)脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離出CCA，ECA和ICA，不閉塞MCA。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫為23～25℃。

分組及給藥:Wistar大鼠64只，分為4組，每組16只。假手術(shù)組用NS等容量，模型組用NS等容量，當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液組用10.0g/kg，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾液組用10.0g/kg，分2次灌胃，連續(xù)灌胃2周，于末次給藥3天后造模，待手術(shù)結(jié)束蘇醒后再給藥1次，給藥量10g/kg。

3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分:再灌注24h，按Longa法［2］對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能行為進(jìn)行評(píng)分。0分為未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀，1分為不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪(輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷)，2分為向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺陷)，3分為向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒(重度神經(jīng)功能缺陷)，4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷。

腦含水量測(cè)定［3］:動(dòng)物處死后，取出大腦稱濕重后將腦組織置于115℃電熱干燥箱中烘至恒重，再稱質(zhì)量，按干濕質(zhì)量法求出腦組織含水量。含水量(%)=［(濕重－干重)/濕重］×100%，腦指數(shù)=(腦濕重/體重)×100。

腦梗死范圍測(cè)定［4］:再灌注24h，斷頭取腦，將腦置冰浴生理鹽水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水沖洗大腦使表面不留血污，吸干周圍水分后，沿冠狀切4刀，切成5片。然后迅速將腦片置5mL含有1%TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30min，每隔7～8min翻動(dòng)1次。經(jīng)染色后正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦片照相，剪下紅白顏色區(qū)稱重計(jì)算。然后根據(jù)重量求面積法分別計(jì)算出5個(gè)腦片共10個(gè)平面的總面積和梗死區(qū)域的面積，求出梗死區(qū)面積占半球總面積的百分比，即梗死率。梗死率=［白區(qū)質(zhì)量/(白區(qū)質(zhì)量+紅區(qū)質(zhì)量)］×100%。

采用SPASS11.5軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率、腦含水量和腦指數(shù)的影響見表1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響(±s)

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

腦指數(shù)假手術(shù)組 16 － 0.00±0.00 0.00±0.00 74.79±2.11 0.45±0.04組別 n 劑量g/kg 行為學(xué)評(píng)分 梗死率 腦含水量(%)模型組 16 － 7.37±0.98△△25.74±0.19△△ 79.28±0.95△ 0.52±0.12△當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液組 16 10.0 3.14±0.57△△11.71±0.62△△ 76.29±2.84△ 0.51±0.03△當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾液組 16 10.0 3.36±0.16△ 12.61±0.77△ 77.16±2.32△ 0.49±0.07△

5 討論

中藥制藥過程一般包括提取、分離、濃縮、干燥和制劑等環(huán)節(jié)。其中，提取單元是中藥制藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，影響著最終藥物制劑的質(zhì)量和成本以及制藥業(yè)的現(xiàn)代化水平。由于中藥復(fù)方的臨床療效是多成分多靶點(diǎn)整體作用的結(jié)果，因此無論活性成分的含量還是它們之間的比例變化均會(huì)影響處方的療效，但目前在中藥復(fù)方純化工藝的篩選時(shí)多選用某一種或一類化學(xué)成分來評(píng)價(jià)工藝的優(yōu)劣，由于評(píng)價(jià)指標(biāo)代表性差而使優(yōu)選所得工藝不能保證療效。

觀察表明，提取液組和超濾液組的梗死率、行為學(xué)評(píng)分、腦含水量和腦指數(shù)沒有組間差異，可見減少超濾液的服用劑量未對(duì)療效造成顯著影響，可用于當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液的純化過程。

［1］Kawamura S，Shirasawa M，F(xiàn)ukasawa H.Attenuated neuropatho1ogy by nivadipine after midd1e cerebra1 artery occ1usion in rats［J］.Stroke，1991，22:51 － 53.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Car1son S，et a1.Reversib1e midd1e cerebra1 artery occ1usion wi1hout craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 － 91.

［3］Young W，Rappaport Z H，Cha1if D J，et a1.Regiona1 brain sodium，potassium and water changes in the rat midd1e cerebra1 artery occ1usion mode1 of ischemia［J］.Stroke，1987，18(4):751－759.

［4］羅勇，董為偉.Wistar大鼠插線法局灶性腦缺血－再灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27(1):1－4.