醫(yī)用臭氧神經(jīng)毒性作用的研究進展

林小雯 傅志儉

山東大學山東省立醫(yī)院麻醉科

醫(yī)用臭氧治療軟組織病變、關節(jié)痛和頸、腰椎間盤突出癥，收到了良好的治療效果，對此已有較多報道[1-4]。臨床上使用的醫(yī)用臭氧是臭氧和氧氣的混合物，具有強氧化性的臭氧是其有效成分。合理的臭氧濃度、劑量及臭氧與髓核組織的充分接觸是取得良好效果的關鍵[5-7]。椎間盤內(nèi)臭氧注射，雖然很少發(fā)生嚴重并發(fā)癥，但醫(yī)用臭氧硬膜外腔注射過程中可能會誤入或滲入蛛網(wǎng)膜下腔[5]，與腦脊液迅速反應，生成的物質(zhì)可能對中樞神經(jīng)細胞產(chǎn)生損傷[8]。為此，本文對目前醫(yī)用臭氧神經(jīng)毒性作用的研究進展進行綜述。

臭氧依靠與生物分子反應生成的活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化物（LOPs）產(chǎn)生治療作用，但是ROS及LOPs若超出了機體的抗氧化能力，就會對機體產(chǎn)生氧化損傷，因此臭氧本身具有細胞毒性和治療的雙重性，在應用過程中稍有不慎就會對機體產(chǎn)生顯著的不良反應。Ginannesch[9]等報道了1例L4/5椎間盤臭氧溶盤術后背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)根受損的病例。同時有報道稱長期接觸低濃度臭氧的復印工人的神經(jīng)功能有早期損傷[10]。而國內(nèi)尚未出現(xiàn)相關的臨床報道。

張維[11]等通過鞘內(nèi)注射不同濃度醫(yī)用臭氧（30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L）對兔行為學和腦、脊髓的超微結(jié)構(gòu)進行了觀察，初步評價了醫(yī)用臭氧是否具有神經(jīng)毒性作用。將30只新西蘭大白兔隨機分為5組（n=6），穿刺對照組（s組）僅行小腦延髓池穿刺；純氧對照組（O2組）行小腦延髓池穿刺后注射醫(yī)用純氧2 ml；不同濃度醫(yī)用臭氧組（O2-O330組、O2-O350組、O2-O380組）行小腦延髓池穿刺后分別注射30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L醫(yī)用臭氧2 ml。分別于麻醉前和注射后24 h測定雙前足熱刺激縮足潛伏期（PWHL）及機械刺激縮足反應閾值（PWMT），并進行運動功能（MF）評分及后肢趾外展（TA）評分。測定神經(jīng)行為學的各項指標后處死兔，取大腦枕葉皮質(zhì)和頸脊髓（C ）組織，透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。PWHL、PWMT和MF評分是反映動物感覺功能和運動功能的常用指標。TA評分是反映脊髓損傷的靈敏指標，同時考慮到臭氧的氧化作用是瞬間完成的，因此同時選取鄰近穿刺部位的大腦枕葉皮質(zhì)和頸脊髓，觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，以便綜合評價醫(yī)用臭氧的神經(jīng)毒性。

實驗結(jié)果示：麻醉前及注射后24 h時PWHL、PWMT、MF評分及TA評分組間及組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同時發(fā)現(xiàn)不同濃度醫(yī)用臭氧組大腦枕葉皮質(zhì)及頸脊髓組織均有不同程度的病理損傷，枕葉皮質(zhì)的病理損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜及神經(jīng)突觸等結(jié)構(gòu)的損傷；頸脊髓的病理損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)元和神經(jīng)纖維等結(jié)構(gòu)性損傷。以上結(jié)果表明臭氧對神經(jīng)元的線粒體有一定的損傷作用，并且隨著臭氧濃度的升高呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢，對神經(jīng)元的其他結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了病理損傷，提示臭氧對中樞神經(jīng)具有一定程度的毒性。

為了進一步評價醫(yī)用臭氧對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，張維[12]等又繼續(xù)觀察了不同濃度醫(yī)用臭氧對腦脊液超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的影響，分別于注射醫(yī)用臭氧前及注射醫(yī)用臭氧后1 h、2 h、4 h采集0.3 ml腦脊液，測定SOD、MDA水平，并計算SOD與MDA的比值（SOD/MDA）。生存和疾病的痊愈有賴于機體的平衡，氧化/抗氧化平衡是其中最重要的平衡之一。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除過多的氧自由基使機體免受損傷。MDA是體內(nèi)主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量變化可間接反映自由基的產(chǎn)生以及膜損傷程度，具有細胞毒性。MDA和SOD分別代表著氧化和抗氧化作用，SOD/MDA可反映二者變化的整體水平。

實驗結(jié)果示：不同濃度醫(yī)用臭氧均能誘導兔腦脊液SOD活性升高，清除氧自由基能力增強；30mg/L、50 mg/L醫(yī)用臭氧可抑制腦脊液MDA濃度升高，對脂質(zhì)過氧化反應有抑制作用，80 mg/L醫(yī)用臭氧可升高腦脊液MDA濃度，表明隨著醫(yī)用臭氧濃度的增加脂質(zhì)過氧化反應增強；SOD/MDA的變化顯示30 mg/L、50 mg/L醫(yī)用臭氧可提高抗氧化水平，80 mg/L醫(yī)用臭氧可抑制抗氧化作用，提示鞘內(nèi)注射高濃度醫(yī)用臭氧有潛在的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

醫(yī)用臭氧的神經(jīng)毒性作用在動物實驗上得到了驗證，但醫(yī)用臭氧對細胞的作用尤其是對神經(jīng)細胞的作用尚不得知，于是本課題組又對不同濃度醫(yī)用臭氧的細胞毒性進行了研究。

周乃寶[8,13]等用不同濃度臭氧（20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞進行干預，證實臭氧對膠質(zhì)細胞是否存在毒性作用。體外培養(yǎng)大鼠Ast并行免疫細胞化學鑒定；大鼠Ast傳代接種后分為5組（n=7），純氧組（O2組）加入400 μl純氧作用20 min后的完全培養(yǎng)基；O320組、O340組、O360組、O380組分別加入400μL的20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml臭氧作用20 min后的完全培養(yǎng)基，分別于2 h、4 h收集細胞懸液及破碎細胞后簡易測定法測定細胞SOD、MDA的含量及乳酸脫氫酶（LDH）漏出率，臺盼藍染色計數(shù)死亡細胞百分比。細胞膜受損后，細胞內(nèi)的酶LDH會釋放增加，表現(xiàn)為LDH漏出率增加，因此通過細胞培養(yǎng)液LDH漏出率的測定可以較客觀地衡量細胞的受損程度。而細胞膜受損后，其通透性發(fā)生改變，臺盼藍等染料易穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，使細胞染色，表現(xiàn)為細胞死亡百分比增高，因此細胞死亡百分比是判斷細胞受損程度較為簡易的指標。周乃寶的相關實驗證明：在不同濃度臭氧對體外培養(yǎng)大鼠Ast細胞干預試驗中，40 μg/ml組LDH漏出率有所降低（P<0.05），死亡細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示細胞未受到損傷。80μg/ml組LDH漏出率、死亡細胞百分比較O3組均明顯升高（P<0.01），且4 h較2 h時升高更明顯（P<0.05或0.01），提示細胞受到了臭氧的損傷作用，并且這種損傷作用隨時間延長而加重。并且在低濃度（20 g/ml、40 g/ml）臭氧干預下，較短時間（2 h、4 h）內(nèi)檢測SOD活力升高，MDA降低；而在高濃度（60 g/ml、80 g/ml）臭氧干預下，短時間（2 h、4 h）內(nèi)檢測MDA升高。

線粒體的功能或結(jié)構(gòu)破壞進而導致神經(jīng)細胞死亡是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病共同的致病因素[14]。動物實驗研究結(jié)果表明，30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L的醫(yī)用臭氧使神經(jīng)元內(nèi)線粒體分別出現(xiàn)腫脹、嵴缺失及空泡化等病理損傷，表明臭氧對神經(jīng)元的線粒體有一定的損傷作用，并且隨著臭氧濃度的升高呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢，對神經(jīng)元的其他結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了病理損傷，提示臭氧對中樞神經(jīng)具有一定程度的毒性。這是張維等人觀察到的臭氧干預后神經(jīng)元在電鏡下的改變，但也有不同的觀察結(jié)果。田錦林[15]等將90μg/ml臭氧注入豬蛛網(wǎng)膜下腔后，觀察豬的行為學、生化指標及光鏡下的脊髓形態(tài)均未見異常改變，推測可能是由于動物種屬不同、蛛網(wǎng)膜下腔容積不同并且醫(yī)用臭氧注射濃度和劑量沒有可比性的原因，從而造成觀察結(jié)果的不同。本實驗小組的細胞實驗結(jié)果證明：低濃度臭氧干預下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞能夠中和氧化物質(zhì)，保證細胞不受損害；而在高濃度臭氧干預下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞的抗氧化能力達到飽和，不能有效中和氧化物質(zhì)，細胞受到損傷。

本實驗小組通過整體動物和體外細胞實驗均證實了醫(yī)用臭氧具有潛在的神經(jīng)毒性作用，并且隨著臭氧濃度的升高，這種損傷作用更明顯。前期實驗均證實臭氧的神經(jīng)毒性可能與其強氧化性有關[8,11-13,16]。在生物體內(nèi)，LOPs及其產(chǎn)物能破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，不飽和脂肪酸是臭氧作用的靶分子，因此細胞膜最容易受損[14]。已有研究結(jié)果證實LOPs直接引起的氧化損傷可誘導細胞凋亡，大劑量則可使細胞死亡。細胞內(nèi)鈣超載是導致神經(jīng)細胞損傷的主要原因[18-21]。為進一步探討臭氧的神經(jīng)毒性作用機制，林小雯[22]等將原代胎鼠脊髓神經(jīng)元接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，隨機分為3組，O3-15組（n=4）和O3-20組（n=8）分別暴露于15 μg/ml、20 μg/ml醫(yī)用臭氧中，對照組（C組，n=5）暴露于空氣中，20 min后采用全細胞膜片鉗技術記錄細胞膜鈣通道的電生理活動。其研究結(jié)果表明，在15μg/ml和20μg/ml臭氧作用下，神經(jīng)元細胞膜上鈣離子通道峰值鈣電流的電壓值向超極化方向分別移動了2.3 mV和2.7 mV，提示低濃度臭氧可使神經(jīng)元鈣通道激活閾值降低且更易激活，這可能是與臭氧增加了大鼠脊髓神經(jīng)元鈣電流密度，且具濃度依賴性和電壓依賴性，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對鈣電流激活過程有明顯的促進作用有關。結(jié)合本研究結(jié)果，推測臭氧引起神經(jīng)元內(nèi)某些磷酸去磷酸化或氧化還原的反應，鈣通道開放活動的改變可能受這些反應的調(diào)控，從而在某種程度上激活了位于細胞膜上的鈣通道，使大量鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，細胞內(nèi)Ca2+超載，導致自由基產(chǎn)生、代謝酶破壞、細胞膜衰竭、細胞骨架的破壞和線粒體呼吸鏈中斷等一系列病理改變，影響了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、膜內(nèi)外信息傳遞、酶活性調(diào)節(jié)及基因表達，觸發(fā)了鈣離子依賴的級聯(lián)反應，誘發(fā)神經(jīng)元損傷和死亡[23-25]。這說明神經(jīng)細胞膜上鈣離子通道激活所誘發(fā)的鈣離子內(nèi)流增加可能是臭氧損傷神經(jīng)細胞的可能作用機制之一。

臭氧的濃度難以精確調(diào)控使其療效不穩(wěn)定，基礎研究和循證醫(yī)學研究不足也是引起爭議的重要原因。目前臭氧的最適注射劑量還沒有確定，基于安全的考慮，我們建議臭氧的臨床使用濃度應控制在30～40μg/m1。30μg/m1的濃度應用于關節(jié)腔、硬膜外腔、肌筋膜等軟組織時，主要發(fā)揮醫(yī)用臭氧的消炎鎮(zhèn)痛作用，40μg/m1的濃度應用于病變椎間盤時，主要發(fā)揮醫(yī)用臭氧的氧化消融作用。然而，根據(jù)目前有關臭氧毒性作用的研究，醫(yī)用臭氧在臨床應用的安全性和其神經(jīng)毒性機制尚有未知。如何正確選擇臭氧的臨床使用濃度和容積，將醫(yī)用臭氧更好地應用于臨床，進一步規(guī)范臭氧疼痛臨床的應用還需要大量進一步的研究。

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