乙型腦炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鑒定及分析

陳娜莎，華榮虹，閆麗萍，趙付榮，王 斌，杜 鵑，王云峰，童光志*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏魯木齊830052；4.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080)

流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，屬于黃病毒科黃病毒屬成員，其基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，含單一開放閱讀框，編碼一個多聚蛋白前體，經(jīng)蛋白酶切割加工后產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)、囊膜糖蛋白(E)和 7個非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5[1-2]。E 蛋白是 JEV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、細胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)中起重要作用[3-5]。

黃病毒屬包括超過70種具有血清交叉反應(yīng)特性的不同病毒，如流行性登革熱病毒(DV)、脾傳腦炎病毒(TBEV)、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、西尼羅病毒(WNV)、墨累河腦炎病毒(MVEV)、昆津病毒(KUNV)和尤蘇它病毒(UV)等[6]。因此，建立一種黃病毒屬病毒間的鑒別檢測方法具有重要的意義。

本實驗室克隆JEV的E蛋白結(jié)構(gòu)域I(EI)基因序列，通過部分重疊的短肽融合表達，鑒定出E蛋白抗原表位E19145GTTTSENHGNYSAQVG160[7-8]。該表位與報道的線性中和表位有12個氨基酸的重疊[9]。

為確定E蛋白抗原表位E19與報道的線性表位是否為同一個中和表位，本研究采用從羧基端(C端)和氨基端(N端)進行逐個氨基酸縮減的方法對E19抗原表位的核心序列進行了精確的定位，并通過JEV株和黃病毒屬不同病毒代表株之間的同源序列比較，設(shè)計一系列表達融合蛋白的短肽，表達轉(zhuǎn)印后研究了E19表位的功能，為進一步研究E蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及建立乙型腦炎臨床鑒別診斷方法奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒pGEX-6P-1和大腸桿菌DH5α及BL21由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自華舜生物公司；紅外熒光標(biāo)記(IRDye700)的抗兔IgG抗體購自Rockland化學(xué)免疫試劑公司。兔抗JEV SA14-14-2株陽性血清由第四軍醫(yī)大學(xué)惠贈。

1.3 E19抗原表位核心序列的短肽的設(shè)計 根據(jù)本實驗室鑒定的線性表位E19序列，用逐個氨基酸縮短的方法，從C端設(shè)計8條短肽和相應(yīng)的寡核苷酸鏈，分別編號為E19-1～8，鑒定出C端序列后再從N端設(shè)計8條短肽和寡核苷酸序列，編號為E19-9～16。短肽序列位置以及其核苷酸序列見表1。在編碼短肽的寡核苷酸鏈5'端引入BamHⅠ位點，3'端引入XhoⅠ位點，反義鏈與編碼鏈互補，退火后形成的雙鏈DNA可直接與酶切處理的載體連接克隆。寡核苷酸鏈由南京金思特科技有限公司合成。

表1 短肽的序列和對應(yīng)的寡核苷酸序列Table 1 The olige nucleotide sequence of designed short peptide expressions

1.4 E19抗原表位氨基酸序列的比較與分析 利用DNAStar軟件對GenBank中登錄的24條JEV的不同病毒株序列和12條黃病毒科不同病毒代表株序列進行同源性比較和分析。

1.5 突變短肽的設(shè)計 根據(jù)序列分析和比較的結(jié)果，選擇了JEV的JKT6468株、MVEV的MRM3929株、MVEV的MVE-1-51株、KUNV的MRM61C株、WNV的NY99株和UV同源序列，參照大腸桿菌密碼子使用頻率表，設(shè)計6條短肽和寡核苷酸序列，編號E19-17～E19-22(表2)。

表2 突變短肽的序列Table 2 The sequence of designed mutation peptides

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達 合成的寡核苷酸正、反義鏈退火后克隆至經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切的pGEX-6P-1質(zhì)粒，重組子經(jīng)酶切鑒定后由北京英駿生物技術(shù)有限公司測序以驗證序列。將重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達后進行超聲裂解，去上清，12%凝膠SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達情況。

1.7 表達產(chǎn)物的western blot分析 樣品經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，以1∶100稀釋的JEV陽性血清為一抗，1∶5 000稀釋的紅外染料標(biāo)記的羊抗兔熒光抗體為二抗，用Odyssey掃描儀進行掃描。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pGEX-6P-1經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后，回收線性化片段，與合成的編碼短肽的核苷酸序列連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組質(zhì)粒分別用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，均得到與預(yù)期大小相同的片段。測序結(jié)果表明插入片段序列完全正確。

2.2 核心序列的定位 陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliBL21后，0.1 mM IPTG誘導(dǎo)4 h，經(jīng)12%SDS-PAGE分析，融合蛋白均獲得表達，表達產(chǎn)物大小在26 ku到34 ku之間，與預(yù)期大小一致(圖1)。C端截短的短肽與JEV陽性血清反應(yīng)的最短序列編號為E19-4，即E19抗原表位從C端縮減為145GTTTSENHGNYS15612個氨基酸；N端截短的短肽與陽性血清反應(yīng)的最短氨基酸序列為E19-13，即E19抗原表位的核心序列最終確定為150ENHGNYS156。

2.3 序列比較和分析 JEV不同病毒株在E19抗原表位所在位置高度保守，同源性較高，只有JKT6468株一個氨基酸有差異(圖2)。不同黃病毒屬病毒代表株之間的差異較大，同源性不高，DV 1、2、3、4型病毒株、TBEV代表株k23和WNV代表株956在該位置同源性小于50%，甚至沒有相同的氨基酸，所以這些序列沒有被選做突變研究的意義(圖 3)。

2.4 突變短肽的誘導(dǎo)表達及western blot分析 結(jié)果表明JEV唯一存在差異的病毒株JKT6468同源序列也能被兔抗JEV陽性血清識別，而其他黃病毒科病毒同源序列不能與JEV陽性血清發(fā)生反應(yīng)(圖4)。

3 討 論

乙型腦炎是一種嚴重的急性人畜共患傳染病，該病的傳播主要集中在亞洲的溫帶地區(qū)，并已逐步擴大到南亞和東南亞。目前，在巴基斯坦北部、印度的西北和西南、西印度尼西亞群島、新幾內(nèi)亞、澳大利亞和美國關(guān)島均分離到病毒，可見其流行區(qū)明顯擴大[10-11]。2006年我國山西等地爆發(fā)了流行性乙型腦炎，世界衛(wèi)生組織公布，平均每年確診的乙型腦炎和登革熱人數(shù)分別有5萬和5千萬之多[10-13]。黃病毒屬中不同的病毒具有血清交叉反應(yīng)特性的不同病毒，其中一些病毒能夠引起發(fā)熱、腦炎等相似的臨床癥狀，但目前卻沒有成熟的鑒別診斷方法，雖然有些病毒還沒有傳入我國，但有必要建立一套可行的快速鑒別診斷方法[14]。

本研究根據(jù)JEV不同病毒株之間和黃病毒屬不同病毒代表株之間的差異，比較和表達分析后表明，24株JEV株同源序列高度保守，唯一一株存在一個氨基酸差異的病毒株JKT6468與兔抗JEV陽性血清也能發(fā)生反應(yīng)，這表明JEV E19抗原表位均能被兔抗JEV血清識別。其他黃病毒屬病毒同源序列與JEV差異性大，相差2個或者3個氨基酸的病毒株序列被選做突變研究，western blot分析的結(jié)果表明其他病毒均不能與JEV陽性血清反應(yīng)，所以初步確定了E19抗原表位具有與WNV、DV和KUNV等黃病毒屬病毒之間鑒別診斷的意義。

本實驗確定的E19抗原表位的核心氨基酸序列150ENHGNYS156，完全包含在報道的線性中和表位中149SENHGNYSAQVGASQ163[9]。本實驗室前期確定的E19序列為145GTTTSENHGNYSAQVG160，在 N端去掉GTTTS 5個氨基酸以后仍能被陽性血清識別，而在C端去掉AQVG 4個氨基酸后能被陽性血清識別，而這4個氨基酸全部包含在已報道的中和線性表位序列中。所以，可以推測出報道的中和表位的核心序列C端可以去掉AQVGASQ 7個氨基酸，最終證明本實驗確定的抗原表位E19和報道的線性中和表位為同一個抗原表位。

本實驗通過結(jié)構(gòu)分析和實驗確定出JEV E蛋白抗原表位的核心序列，即缺少任意一個氨基酸都不能使抗原與抗體結(jié)合的序列；并且通過同種病毒之間和同屬不同病毒之間的差異性比較，進行抗原性分析，這樣的方法不依賴于多種不同病毒抗原。同時，核心氨基酸序列的確定為進一步研究E蛋白結(jié)構(gòu)域生物學(xué)功能以及糖基化位點在病毒毒力變化中的作用奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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