小鼠IL-1β、TNF-αTaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及腦心肌炎病毒感染小鼠的檢測

陳宏備，施開創(chuàng)，李向濤，鄭 敏，鄭喜邦*，李 軍

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧530001)

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)能夠引起人畜共患疾病，EMCV感染主要引起仔豬的腦炎、心肌炎以及母豬的繁殖障礙。我國于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒分離到EMCV[1]，血清學(xué)調(diào)查表明我國規(guī)模化豬場感染EMCV現(xiàn)象普遍存在[2]。小鼠對EMCV極為易感，主要表現(xiàn)為急性腦炎、心肌炎、糖尿病、睪丸炎、眼結(jié)膜炎等[3]，因此一般利用小鼠作為動物模型研究EMCV的致病機(jī)理。已有研究報道EMCV感染小鼠后心肌中IL-1β、TNF-α的上調(diào)水平與心肌炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]，感染致心肌炎型EMCV或致糖尿病型EMCV的小鼠經(jīng)用抗IL-1β或TNF-α的單克隆抗體(MAb)處理后心肌炎或糖尿病的發(fā)病率顯著下降[5-7]，表明促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α在EMCV的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究建立了小鼠IL-1β、TNF-α的TaqMan real-time PCR檢測方法，為定量檢測促炎細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平、探討EMCV的致病機(jī)制提供有效的技術(shù)平臺。

1 材料和方法

1.1 病毒及實(shí)驗(yàn)動物 EMCV GXLC株(FJ897755)由廣西動物疫病預(yù)防控制中心分離鑒定和保存[8]，在BHK-21細(xì)胞系中傳至第3代，病毒效價為108.2TCID50/mL。4周齡SPF級BALB/c雄性小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，經(jīng)RT-PCR及中和抗體試驗(yàn)檢測EMCV均為陰性。

1.2 主要試劑及儀器TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HindⅢ和EcoRⅠ限制酶、pMD18-T載體和膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；E.coliDH5α株感受態(tài)細(xì)胞、2×TaqPCR MasterMix試劑和總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；ROX參比染料購自天津天浩源科技有限公司。ABI Stepone plus型實(shí)時定量PCR儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3 引物及探針的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的小鼠IL-1β、TNF-α基因及管家基因β-actin的序列，利用Primer Express 3.0軟件包設(shè)計特異性擴(kuò)增引物和TaqMan探針(表1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采取健康小鼠脾臟，應(yīng)用總RNA提取試劑盒抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增β-actin、IL-1β及TNF-α基因片段。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后，連入pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為 p-β-actin、p-IL-1β 和 p-TNF-α，放置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 測定質(zhì)粒的OD值，OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0的質(zhì)粒方可用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)OD260nm值計算質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù)[9]，以雙蒸水10倍系列稀釋成7個梯度(p-β-actin 為 3.46×109～3.46×103copies/μL，p-IL-1β 為 1.94×109～1.94×103copies/μL，p-TNF-α為 2.50×109～2.50×103copies/μL)。以此為模板，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將p-β-actin、p-IL-1β及p-TNF-α質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成為含有1×100～1×106copies/μL的7個梯度，以此作為模板進(jìn)行real-time PCR，確定檢出下限。

1.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用設(shè)計的特異性引物，分別以健康小鼠的腦、心、脾等組織抽提總RNA反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA為模板，進(jìn)行real-time PCR以分析其特異性。設(shè)立的對照包括質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、總RNA為模板、cDNA為模板但不加引物、cDNA為模板但不加探針、雙蒸水為模板等5種對照。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 將每種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個濃度梯度(p-β-actin 為 3.46×109、3.46×107、3.46×105copies/μL， p-IL-1β 為 1.94 ×109、 1.94 ×107、1.94 ×105copies/μL，p-TNF-α 為 2.50×109、 2.50×107、2.50×105copies/μL)，進(jìn)行組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 Real-time PCR的應(yīng)用 將28只4周齡BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組18只、對照組10只。試驗(yàn)組經(jīng)腹腔接種0.2 mL 100 LD50EMCV細(xì)胞毒，對照組經(jīng)腹腔接種0.2 mL DMEM營養(yǎng)液。每日觀察臨床癥狀；對死亡或?yàn)l死小鼠及時迫殺，觀察組織病變，并采集腦、心、脾等組織，用于檢測病毒含量及IL-1β、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

分別稱取腦、心、脾等組織，應(yīng)用總RNA提取試劑盒抽提總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo(dT)18反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取總cDNA作為模板，分別采用特異性引物，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行realtime PCR，檢測樣本中 β-actin、IL-1β 及 TNF-α的拷貝數(shù)。

表1 擴(kuò)增β-actin、IL-1β及TNF-α部分基因片段的引物、探針和PCR條件Table 1 Conditions of PCR,primers and probes to amplify partial gene of β-actin,IL-1β and TNF-α

應(yīng)用廣西動物疫病預(yù)防控制中心建立的EMCVTaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法(待發(fā)表)，以上述獲得的cDNA為模板，進(jìn)行real-time PCR，檢測樣本中EMCV的拷貝數(shù)。

迫殺同群、未接種EMCV的6只4周齡BALB/c雄性小鼠，取腦、心、脾等組織，應(yīng)用建立的熒光定量RT-PCR測定EMCV含量以及β-actin、IL-1β和TNF-α基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，作為感染前(第0 d)的對照數(shù)據(jù)。

以含有β-actin 10 000個拷貝的組織中所含有的IL-1β、TNF-α拷貝數(shù)來表示相應(yīng)促炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。EMCV含量以每克組織中所含的拷貝數(shù)來表示。采用t檢驗(yàn)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 由小鼠脾臟提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增管家基因β-actin以及IL-1β、TNF-α基因，得到了與目的片段大小相符的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆，獲得陽性菌。提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR、EcoRⅠ和HindⅢ酶切以及測序鑒定，證實(shí)構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 Real-time PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 經(jīng)優(yōu)化，real-time PCR 25 μL 反應(yīng)體系為：Realtime 2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(20 pmol/μL)各 0.5 μL，ROX 參比染料 0.5 μL，熒光探針(20 pmol/μL)0.6 μL， cDNA 模 板 2.0 μL， ddH2O 8.4 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃15 s，55℃～60℃30 s，40個循環(huán)。

2.3 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行real-time PCR，得到檢測β-actin、IL-1β以及TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到0.998以上。

2.4 敏感性分析 經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果分析，p-β-actin、p-IL-1β及p-TNF-α的檢出下限均為1×101copies/μL(圖 3)。

2.5 特異性分析 以cDNA或以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、并加齊real-time PCR所需各組分時，β-actin、IL-1β及TNF-α獲得特異性的擴(kuò)增曲線，其它各種對照均為陰性。以腦的特異性反應(yīng)結(jié)果為例見圖4。

2.6 重復(fù)性分析 對p-β-actin、p-IL-1β及p-TNF-α質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的3個濃度梯度進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示Ct值組內(nèi)及組間的變異系數(shù)(CV)均小于2%(表 2)。

2.7 Real-time PCR的應(yīng)用 4周齡BALB/c雄性小鼠經(jīng)腹腔接種EMCV后第2 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為被毛粗亂、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、蜷縮、流淚、呼吸急促，出現(xiàn)震顫、轉(zhuǎn)圈、側(cè)頸、后肢麻痹等明顯的神經(jīng)癥狀，接毒的18只小鼠分別于感染后第3 d死亡1只、第4 d死亡7只、第5 d死亡6只、第6 d死亡4只，表明BALB/c小鼠對豬源EMCV GXLC株高度易感。未接種病毒的10只對照小鼠觀察到第8 d未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象(圖5)。

表2 TaqMan real-time PCR的重復(fù)性分析Table 2 Reproducibility assay of theTaqMan real-time PCR

應(yīng)用TaqMan real-time PCR對EMCV感染死亡小鼠腦、心、脾中的病毒含量進(jìn)行檢測，結(jié)果感染第3 d之后均可在腦、心、脾中檢測到大量病毒，并且病毒含量腦中顯著高于心、脾中(p<0.05)，而心、脾中的病毒含量差異不顯著(p>0.05)(圖6)。

應(yīng)用TaqMan real-time PCR，檢測EMCV感染后不同時間死亡小鼠的腦、心、脾中IL-1β、TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦、心、脾中IL-1β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在感染后第3 d即顯著上調(diào)，第4 d達(dá)到高峰，此后有所下降，但均顯著高于對照小鼠的轉(zhuǎn)錄水平(圖7)。腦、心、脾中TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在感染后第3 d即顯著上調(diào)，其中腦、心在第4 d達(dá)到高峰，而脾在第6 d達(dá)到高峰，并且腦、脾中的轉(zhuǎn)錄水平在所有時間點(diǎn)均顯著上調(diào)，而心中的轉(zhuǎn)錄水平則在第3 d和第4 d顯著上調(diào)(圖 8)。

3 討 論

為了從分子水平研究EMCV的致病機(jī)制，本研究針對小鼠管家基因β-actin以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測 β-actin、IL-1β 及TNF-α基因的real-time PCR檢測方法。結(jié)果表明，TaqMan real-time PCR的線性關(guān)系很好，直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到0.998以上；檢出下限均達(dá)到1×101拷貝/μL；特異性強(qiáng)，僅以總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，并加入特異性引物和探針的反應(yīng)才能夠檢測到熒光信號；重復(fù)性好，各種濃度質(zhì)粒模板的Ct值相對固定，組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于2%。本研究應(yīng)用所建立的TaqMan real-time PCR方法，對EMCV接種后不同時間死亡小鼠的腦、心、脾中IL-1β、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，進(jìn)一步證實(shí)了其可靠性。

促炎細(xì)胞因子是由細(xì)胞分泌、能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)作用的小分子多肽，其中IL-1和TNF-α是其主要成員[10]。IL-1作為內(nèi)源性熱質(zhì)，引起發(fā)熱；促進(jìn)肝細(xì)胞合成急性期蛋白(APP)；刺激免疫和炎性應(yīng)答的各種效應(yīng)細(xì)胞，參與募集白細(xì)胞到炎癥位點(diǎn)的過程。TNF-α作為內(nèi)源性熱質(zhì)，引起發(fā)熱；能夠上調(diào)白細(xì)胞遷移所需的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，并進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以增強(qiáng)其趨化性、吞噬作用、脫粒以及超氧化物的快速產(chǎn)生。有文獻(xiàn)報道，患有急性心肌炎的病人血清中的IL-1β、TNF-α含量顯著升高[11]；對心肌具有親嗜性的柯薩奇B3病毒(CB3)感染小鼠后，心肌中過量表達(dá)的IL-1β、TNF-α嚴(yán)重影響心肌的收縮功能[12-13]；致心肌炎型EMCV-M株感染小鼠后，心肌中IL-1β、TNF-α的上調(diào)水平與心肌炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4,14]。該結(jié)果提示，IL-1β、TNF-α在心肌炎的發(fā)生過程中起到重要作用。Tetsuo Shioi等以及Huang等的研究均表明，EMCV-M株感染小鼠后，心肌中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平在感染后第3 d迅速提高，第7 d達(dá)到高峰，此后逐漸下降[4,14]。本研究中豬源EMCV GXLC株感染死亡的小鼠，其腦、心、脾中IL-1β、TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在感染后第4 d達(dá)到峰值(除脾中TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在第6 d達(dá)到峰值外)，而此時感染小鼠的臨床癥狀最明顯、死亡率也達(dá)到高峰，提示組織中IL-1β、TNF-α的過量表達(dá)與感染動物的發(fā)病和死亡密切相關(guān)。與Shioi等和Huang等的報道有所差異，這可能與使用不同的病毒株、接種病毒劑量、小鼠品系有關(guān)[4,14]。

目前，實(shí)驗(yàn)室常用TaqMan探針法和SYBR GreenⅠ染料法real-time PCR定量檢測細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[8]。由于SYBR GreenⅠ可以非特異性地與所有雙股DNA結(jié)合，反應(yīng)體系中的引物二聚體、污染的基因組DNA以及其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均會導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，因而SYBR GreenⅠreal-time PCR有其局限性。TaqMan real-time PCR則利用上、下游引物及探針使反應(yīng)的特異性具有雙重保證，從而確保檢測結(jié)果的可靠性。本研究利用TaqMan探針法的優(yōu)勢，建立了小鼠IL-1β、TNF-α的Taq-Man real-time PCR檢測方法，為利用小鼠作為動物模型，研究EMCV的致病機(jī)制提供了必要的技術(shù)平臺。

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