微小隱孢子蟲(chóng)病毒衣殼蛋白抗體檢測(cè)ELISA方法的建立

刁玉梅，宮鵬濤，李 巍，蘇利波，黃祥盛，高華義，李 赫，胡進(jìn)平，李建華，張西臣

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062)

隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)是普遍存在的胃腸道寄生性原蟲(chóng)，能引起人類(lèi)與家畜的群體腹瀉[1-3]。目前，還沒(méi)有有效的治療方法治療人的隱孢子蟲(chóng)感染，而現(xiàn)行的常規(guī)診斷方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、檢出率低；間接熒光抗體試驗(yàn)和PCR方法對(duì)儀器設(shè)備和試劑的要求較高，因此建立一種快速、特異性較高且可直接判定結(jié)果的診斷方法是十分必要的。

分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示出大多數(shù)人隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidiosis)是由人隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium hominis，C.parvumgenotypeⅠ)和微小隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium parvum，C.parvumgenotypeⅡ)引起的[4]。微小隱孢子蟲(chóng)病毒(Cryptosporidium parvumvirus，CSpV)是1997年Khramtsov在牛犢中分離出來(lái)的C.parvum卵囊中發(fā)現(xiàn)的，該病毒含有含larger dsRNA(L-dsRNA)和 smaller dsRNA(S-dsRNA)， 其中S-dsRNA編碼病毒衣殼蛋白[5]。之后，Khramtsov又發(fā)現(xiàn)所有C.hominis和C.parvum都含該dsRNA病毒，而Cryptosporidium其他種中不存在[6]。因此可以把CSpV的分子特征和抗原特性作為檢測(cè)C.hominis和C.parvum卵囊的一個(gè)依據(jù)。該病毒衣殼蛋白基因S-dsRNA可作為對(duì)人具有感染性的隱孢子蟲(chóng)(C.hominis和C.parvum)與其它種類(lèi)隱孢子蟲(chóng)鑒別的一個(gè)分子標(biāo)記和含病毒蟲(chóng)株的分離和鑒定的依據(jù)[7]。本研究利用在E.coliBL21(DE3)表達(dá)的S-dsRNA蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)人的隱孢子蟲(chóng)感染的間接ELISA方法。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CSpV衣殼蛋白表達(dá)菌pET-28a(+)-S、鼠抗安氏隱孢子蟲(chóng)(C.andersoni)陽(yáng)性血清、鼠抗弓形蟲(chóng)(T.gondii)陽(yáng)性血清、鼠抗藍(lán)氏賈第蟲(chóng)(G.lamblia)陽(yáng)性血清、鼠抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)(E.tenella)陽(yáng)性血清均由本室制備。體質(zhì)量18 g～20 g的6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠6只，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品所。

1.2 主要試劑 Ni-NTA親和層析柱為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；咪唑?yàn)槊绹?guó)Sigma公司產(chǎn)品；尿素為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；L-Arg為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，脫脂奶粉，兔血清封閉液均為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.3 目的蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性 將陽(yáng)性表達(dá)菌按1%的比例接種于500 mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2 h～3 h，至菌液OD600nm值為0.4～0.6時(shí)加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集菌液。按照Ni-NTA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的蛋白的純化。用含有8 M，6 M，4 M，2 M，0 M尿素，0.5 M L-Arg的PBS溶液進(jìn)行梯度透析復(fù)性。用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.4 鼠抗C.parvum陽(yáng)性血清的制備 取純化的2×107個(gè)C.parvum卵囊溶于PBS中，超聲粉碎至鏡檢無(wú)卵囊，12 000 r/min 20 min，取上清作為抗原。用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用該抗原腹腔免疫6只6周齡～8周齡的BALB/c小鼠(100 μg/只)，按常規(guī)免疫程序制備陽(yáng)性血清。

1.5 檢測(cè)人的隱孢子蟲(chóng)感染的間接ELISA方法的建立

1.5.1 封閉劑的選擇 用重組蛋白包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。以10%胎牛血清、10%正常兔血清、5%脫脂奶粉為封閉劑，用PBST稀釋，每孔加200 μL，37℃孵育2 h。洗滌后封閉2 h，分別加陽(yáng)性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照，37℃孵育1 h。洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h。洗滌后加入底物，觀察顏色變化。顯色后，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(P)、陰性對(duì)照(N)和空白對(duì)照，P/N>2，判為陽(yáng)性。選擇封閉效果最佳者。

1.5.2 抗原和一抗工作濃度的確定 用不同濃度1 μg/孔、0.5 μg/孔、0.25 μg/孔、0.125 μg/孔、0.0125 μg/孔、0.00 625 μg/孔的重組蛋白包被酶標(biāo)板，用不同稀釋倍數(shù) 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200的陽(yáng)性血清孵育，進(jìn)行間接ELISA，確定抗原和一抗最佳工作濃度。

1.5.3 羊抗鼠HRP-IgG二抗工作濃度的確定 選擇最佳封閉劑，抗原和一抗按最佳工作濃度稀釋，將HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗稀釋為不同濃度1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000。加底物緩沖液顯色，測(cè)定OD490nm值，確定二抗最佳工作濃度。

1.5.4 間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 檢測(cè)12份健康小鼠血清，測(cè)定OD490nm值，計(jì)算平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD。

1.5.5 敏感性試驗(yàn) 將鼠抗C.parvum陽(yáng)性血清按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200 倍比稀釋，應(yīng)用已建立的間接ELISA，確定其敏感性。

1.5.6 特異性試驗(yàn) 以鼠抗C.parvum陽(yáng)性血清和陰性血清為對(duì)照，用已建立的間接ELISA方法測(cè)定鼠抗C.andersoni陽(yáng)性血清、鼠抗T.gondii陽(yáng)性血清鼠、抗G.lamblia陽(yáng)性血清、鼠抗E.tenella陽(yáng)性血清，觀察血清交叉反應(yīng)情況，來(lái)確定其特異性。

1.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 檢測(cè)7份陽(yáng)性血清樣品，每份血清樣品重復(fù)3孔，按照間接ELISA的操作程序進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每份血清樣品OD490nm值的變異系數(shù)(CV)，以檢驗(yàn)批內(nèi)被檢測(cè)樣品的重復(fù)性；另取3塊用純化重組蛋白包被的酶標(biāo)板，相同條件下檢測(cè)7份陽(yáng)性血清樣品，按照間接ELISA的操作程序進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份血清樣品在不同板間OD490nm值的CV，以檢驗(yàn)批間被檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

1.5.8 待檢血清的檢測(cè)試驗(yàn) 取8只BALB/c小鼠免疫抑制5 d后，在第6 d分別灌胃接種105個(gè)純化的C.parvum卵囊。接種20 d后尾靜脈采血，用上述間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。另取20只健康BALB/c小鼠與上述小鼠一同飼養(yǎng)20 d，然后尾靜脈采血，用上述間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 目的蛋白的純化 重組蛋白陽(yáng)性表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白。純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析可見(jiàn)在約40 ku處有一蛋白帶(圖1)。

2.2C.parvum抗體檢測(cè)ELISA方法的建立 根據(jù)測(cè)定結(jié)果，選擇最佳封閉液為5%脫脂奶粉的PBST溶液，最佳抗原包被濃度0.25 μg/孔、被檢血清稀釋度1∶200，羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)1∶2 000為最佳檢測(cè)條件。

2.3 間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 經(jīng)間接ELISA檢測(cè)12份健康小鼠血清OD490nm值平均值為0.216，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.026，因此陽(yáng)性樣品檢出下限為X+3SD=0.294。為了減少假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)，將臨界值加減一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為可疑區(qū)間[8]。因此，當(dāng)OD490nm≥0.32時(shí)，樣品判定為陽(yáng)性；當(dāng)OD490nm<0.268時(shí)，樣品判定為陰性；當(dāng)0.268≤OD490nm<0.32時(shí)，樣品判定為疑似(表1)。

表1 間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定Table 1 Performance and optimal cutoff values for indirect ELISA

2.4 敏感性試驗(yàn) 根據(jù)表2可以得出，當(dāng)陽(yáng)血清稀釋到1∶1 600時(shí)，OD490nm≥0.32，樣品仍可判定為陽(yáng)性，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋到1∶3 200時(shí)，OD490nm<0.268，樣品判定為陰性。因此，間接ELISA檢測(cè)方法的敏感度為1∶1 600，表明該方法的敏感性較高。

表2 ELISA檢測(cè)的敏感性Table 2 The sensitivity test of the ELISA

2.5 特異性試驗(yàn) 根據(jù)表3檢測(cè)結(jié)果顯示，用建立的間接ELISA方法檢測(cè)鼠抗C.andersoni陽(yáng)性血清、鼠抗T.gondii陽(yáng)性血清鼠、抗G.lamblia陽(yáng)性血清、鼠抗E.tenella陽(yáng)性血清均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法特異性較強(qiáng)。

表3 ELISA檢測(cè)的特異性Table 3 The specificity test of the ELISA

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)CV均值為2.59%，批間重復(fù)試驗(yàn)CV最大值為10.5%，表明該方法具有可重復(fù)性(表4)。

2.7 待檢血清的檢測(cè)試驗(yàn) 用上述間接ELISA方法對(duì)8份感染C.parvum卵囊的小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示8份血清樣品均為陽(yáng)性；另外20份小鼠血清中陽(yáng)性血清13份，陰性血清7份，陽(yáng)性率為65%。

表4 間接ELISA的批內(nèi)、批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the indirect ELISA

3 討 論

本研究利用已驗(yàn)證的CSpV衣殼蛋白表達(dá)菌大量純化目的蛋白，將復(fù)性蛋白作為包板抗原，建立了檢測(cè)含病毒隱孢子蟲(chóng)的間接ELISA方法。

在ELISA反應(yīng)中，非特異性吸附是影響ELISA方法成敗的關(guān)鍵因素?？乖粷舛?、封閉劑種類(lèi)、一抗稀釋倍數(shù)和二抗稀釋倍數(shù)等直接影響著試驗(yàn)結(jié)果，因此通過(guò)試驗(yàn)確定封閉效果最佳的封閉劑和抗原、一抗、二抗的最佳工作濃度。結(jié)果表明5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h能夠起到較好封閉效果，減少了非特異性吸附。陰陽(yáng)性血清1∶200稀釋，符合陰性血清OD490nm值最小，而且陽(yáng)性血清的OD490nm值在1.0附近時(shí)血清最大稀釋倍數(shù)的要求，提高了ELISA檢測(cè)的敏感性和特異性。

該間接ELISA方法使用的重組蛋白不與鼠抗C.andersoni陽(yáng)性血清、鼠抗T.gondii陽(yáng)性血清、鼠抗G.lamblia陽(yáng)性血清、鼠抗E.tenella陽(yáng)性血清反應(yīng)，而只與鼠抗C.parvum陽(yáng)性血清反應(yīng)，具有較高的特異性。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為1.30%～6.46%，批間重復(fù)試驗(yàn)4.05%～10.5%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

利用本研究建立的ELISA方法檢測(cè)8份感染微小隱孢子蟲(chóng)的小鼠血清，結(jié)果顯示8份血清均為陽(yáng)性樣品。同時(shí)利用該方法檢測(cè)20份與感染C.parvum的小鼠一同飼養(yǎng)的小鼠血清，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為65%。研究結(jié)果表明本研究建立的間接ELISA方法可用于檢測(cè)C.parvum免疫血清和C.parvum感染小鼠血清，并且可用于C.parvum自然感染的檢測(cè)。

本研究建立的間接ELISA方法，其抗原易于純化和大量制備，操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，可重復(fù)性好，便于推廣，為C.hominis和C.parvum的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研制CSpV衣殼蛋白單克隆抗體提供條件。

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