H9N2亞型豬流感病毒對小鼠的致病性及其分子特性研究

張瑞華，崔紅玉，徐明舉，利 凱，陳化蘭，王存連，魏 東，李寸欣，徐 彤*

豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，片段4、5、6和7分別編碼HA、NP、NA和M蛋白，其中片段4和6的變異率較高[1-2]。一般認為流感病毒具有宿主限制性，但自然條件下經(jīng)常發(fā)生禽和人流感病毒傳染豬的病例[3-5]。自1976年SIV傳染給人引起發(fā)病和導致死亡以來，該病毒不斷在人-豬-禽間傳播[6-7]。特別是近年來發(fā)生的H5N1、H9N2和H7N7亞型流感病毒直接感染人、導致人死亡的事件，更引起了人們對流感病毒的關注。目前，對流感病毒的研究集中在高致病性流感病毒方面。而本研究對H9N2亞型SIV進行克隆、遺傳進化分析及其對小鼠致病性的研究，初步了解該病毒的分子進化特征以及其對哺乳動物的致病性，為進一步研究其對哺乳動物致病機理，尤其是肺損傷的機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株和實驗動物 大腸桿菌DH5α由河北北方學院微生物傳染病實驗室保存；SPF級6周齡～8周齡、雌性BALB/c小鼠和SPF雞胚購自北京實驗動物研究中心。

1.2 質(zhì)粒、引物及相關試劑 RNA提取試劑OMEGA Bioteck RNA-Solv Reagent、TaKaRa One step RNA PCR Kit(AMV)、pMD18-T Vector以及相關限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程服務有限公司。引物根據(jù)GenBank登錄的病毒A/swine/Guangxi/7/2007(H9N2)(CY075030)基因序列設計并由上海生工生物工程服務有限公司合成。

表1 HA、NA、NP和M基因的引物序列Table 1 The primer sequences of HA,NA,NP and M gene of SIV

1.3 病毒分離和鑒定 2008年11月河北省某豬場部分豬出現(xiàn)呼吸困難、流淚、氣喘、咳嗽、高熱以及全身皮膚淤血癥狀，部分仔豬死亡，剖檢可見肺臟有明顯出血變化，肺腫大，氣管內(nèi)有泡沫狀液體，疑似為流感病毒引起。采集該場發(fā)病豬的鼻拭子20份和病死豬的肺、氣管等病料樣品12份，按常規(guī)方法處理后尿囊腔接種9日齡～11日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚，37℃孵化72 h，無菌收集尿囊液，以1%雞紅細胞檢測其血凝性。將盲傳3代后仍保存血凝活性的樣品由哈爾濱獸醫(yī)研究所進行亞型鑒定。相關操作和結(jié)果判定參見文獻[8]。

1.4 對SPF雞的致病性試驗 按照參考文獻[9]方法進行，確定其靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)(IVPI)。

1.5 小鼠致病性試驗 將48只6周齡～8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為3組，每組16只。第1組及第2組中的8只小鼠以經(jīng)無菌PBS 1∶10稀釋的分離株雞胚尿囊液100 μL經(jīng)點眼和滴鼻途徑感染；第2組另外8只小鼠不接種，但與感染鼠共同飼養(yǎng)；第3組小鼠接種等體積生理鹽水作為對照。

1.6 臨床癥狀和病理組織學觀察 接種后每天觀察小鼠臨床癥狀，選取第1組中8只小鼠，定期稱量體質(zhì)量并記錄采食量，統(tǒng)計小鼠死亡率并及時剖檢死亡小鼠，無菌采取主要器官樣品用于病毒分離和病理組織學觀察；第1組中另外8只小鼠以及第2組的小鼠在感染后第2 d、6 d和14 d各迫殺2只，無菌采取各主要臟器樣品進行病理學檢查和病毒分離。病料樣品采取后固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡觀察各組織病理變化。

1.7 RT-PCR檢測 參照OMEGA Bioteck RNASolv Reagent說明書提取病毒基因組RNA，并以其為模板，以表1中引物，參照TaKaRa One step RNA PCR Kit(AMV)說明書進行RT-PCR擴增。

1.8 RT-PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定和序列測定 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定。并采用核酸回收試劑盒回收，連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α細胞，篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由TaKaRa公司進行序列測定。

1.9 序列分析 應用DNAMAN.full.version.v5.2.2軟件對測序基因片段進行核苷酸序列和推導的氨基酸序列的同源性比較。結(jié)合GenBank中登錄的流感病毒序列進行遺傳進化分析，并繪制進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離和鑒定 將小鼠組織病料及鼻拭子共32份樣品接種SPF雞胚，盲傳至第3代，在鼻拭子及肺組織中均分離到流感病毒，篩選出其中血凝效價為26～29并且比較穩(wěn)定的尿囊液2份，由哈爾濱獸醫(yī)研究所進行鑒定，結(jié)果確定該分離株為A型流感病毒H9N2亞型，并命名為A/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)(簡稱 SW/HB/0/08)。

2.2 對SPF雞的致病性試驗 以0.1 mL/只的劑量接種6周齡SPF雞10只，接種后第3 d，實驗雞開始發(fā)病，臨床表現(xiàn)大致相同，只表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀。經(jīng)測定，其IVPI為0.52(表2)，表明該分離株為低致病性病毒株。

表2 分離株IVPI測定結(jié)果Table 2 IVPI determination of the isolates

2.3 小鼠致病性試驗 將含有SW/HB/0/08病毒的雞胚尿囊液接種小鼠14 d內(nèi)，第1組中的8只小鼠全部出現(xiàn)精神不振、不愿運動、嗜睡等癥狀，體質(zhì)量以及采食量明顯下降，其中嚴重者體質(zhì)量只有正常的2/3，3只小鼠在感染后3 d～6 d內(nèi)死亡；第2組接種病毒的小鼠在感染后2 d也出現(xiàn)與第一組相似的臨床癥狀，未接種病毒的8只小鼠未見異常癥狀；對照組小鼠無異常變化。

2.4 感染小鼠的臨床癥狀及組織病理學觀察 小鼠在感染SW/HB/0/08后表現(xiàn)精神沉郁、采食量下降、活動減少、被毛粗亂、體重明顯下降，呼吸急促、頻率加快、極度呼吸困難，部分小鼠出現(xiàn)后肢麻痹等癥狀。對照組小鼠無異常。將感染小鼠剖檢可見：肺部明顯水腫、淤血和出血、體積增大、肺濕重明顯增加，為正常小鼠肺濕重的3倍～5倍(正常/感染：0.1 g～0.2 g/0.3 g～0.67 g)；支氣管內(nèi)流出大量的血色泡沫樣液體；肝臟有輕微淤血；心、脾、腦和腎臟未見明顯的眼觀變化。將組織臟器樣品按常規(guī)方法處理后接種10日齡SPF雞胚，感染組從其接種雞胚的尿囊液中重新分離到SW/HB/0/08病毒，同群感染組以及對照組小鼠各種器官未見異常，也未分離到病毒，表明該流感病毒株對小鼠有致病性，同群接觸不能導致小鼠發(fā)生感染。

感染鼠組織病理學損傷主要發(fā)生于肺部，表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷變化：肺泡壁和肺泡間質(zhì)明顯水腫增厚、出血以及炎性細胞滲出，在肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)有大量的紅細胞以及炎性細胞；細支氣管和小血管周圍水腫、疏松，有大量的炎性細胞；小支氣管粘膜脫落，管腔中可見脫落的氣管粘膜上皮(圖1-A)。其他組織變化表現(xiàn)為：肝臟出現(xiàn)不同程度的淤血，在肝小葉的中央靜脈和肝竇狀隙內(nèi)有大量的紅細胞淤積(圖1-B)；腎臟淤血，腎小管上皮細胞腫脹，管腔縮小，腎小管上皮向管腔內(nèi)形成突起(圖1-C)；心肌纖維間有輕度的淤血和出血(圖略)；腦組織呈現(xiàn)輕度的淤血變化(圖略)。對照組小鼠相關組織未見病理學變化(圖D、E和F)。

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增得到的4個基因片段HA、NA、NP和M分別約為1 600 bp、1 500 bp、1 500 bp、1 000 bp與預期(1 592 bp、1 424 bp、1 518 bp、990 bp)大小相符。

2.6 各基因片段的克隆和序列測定 將HA、NA、NP和M基因片段回收后連接到pMD18-T載體中，經(jīng)PCR篩選鑒定的陽性重組質(zhì)粒進行序列測定和拼接。拼接后的序列錄入NCBI中，登錄號分別為CY063662、CY063664、CY063663和 CY063665。

2.7 各基因片段的序列分析

2.7.1 HA基因的序列分析 所擴增的HA基因片段長為1 592 bp，全部參與編碼，共編碼530個氨基酸，裂解位點序列為PARSSR↓GLF，序列呈R-X-X-R，其中含有2個堿性氨基酸，符合低致病性流感病毒的裂解位點。HA基因與GenBank中登錄的CK/HB/4/08 HA基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列的同源性最高，均為99%。與A/mallard/Switzerland/WV3080036/2008(H9N2)(Mallard/Switerland)的核苷酸和氨基酸序列的同源性最低，分別為83%和90%。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示：HA基因的進化分為2個譜系，國內(nèi)分離株屬于同一譜系，國外分離株屬于另一譜系，該分離株HA基因與CK/HB/4/08位于同一分支，親緣關系較近，位于國內(nèi)的分支譜系，與國外分離株A/chicken/korea/4/2003(H9N2)(CK/Korea/S4/03)的親緣關系較遠(圖2)。

2.7.2 NA基因的序列分析 NA基因全長1 424 bp，編碼區(qū)為13位～1 413位，編碼467個氨基酸。將NA編碼區(qū)全長基因序列與GenBank中登錄流感毒株的核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行同源性比較顯示：分離株NA基因的核苷酸序列以及推導的氨基酸序列與CK/HB/4/08的同源性最高，分別為99%和100%；與A/chicken/Shandong/B4/2007(H9N2)(CK/SD/B4/07)核苷酸序列以及推導的氨基酸序列同源性均為98%；與其余在NCBI中登錄的NA基因序列同源性均在98%以下；與A/Chicken/Korea/38349-96323/96(H9N2)(CK/Korea/38349)核苷酸序列以及推導的氨基酸序列同源性最低，均為86%。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示：NA的進化分為2個譜系，國內(nèi)分離株屬于同一譜系，國外分離株屬于另一譜系，該分離株NA基因與CK/HB/4/08位于同一分支，親緣關系較近，位于國內(nèi)的分支譜系，與國外分離株CK/Korea/38349親緣關系較遠(圖3)。

2.7.3 NP基因的序列分析 NP基因全長1 518 bp，編碼區(qū)為19位～1 515位，編碼498個氨基酸。NP基因與GenBank中登錄的CK/HB/4/08株NP基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列同源性最高，均為99%；與A/swine/Guangxi/S11/2005(H9N2)同源性最低，分別為95%和98%。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示：該分離株NP基因與CK/HB/4/08位于同一分支，親緣關系較近。

2.7.4 M基因的序列分析 M基因全長990 bp，編碼區(qū)由兩部分組成，分別編碼M1蛋白和M2蛋白。M1基因編碼區(qū)在6位～764位，編碼252個氨基酸；M2基因編碼區(qū)分兩部分：第一部分在6位～31位，第二部分在720位～987位，通過RNA編輯組成，編碼97個氨基酸。M2蛋白具有禽流感病毒特異性的氨基酸殘基(Thr11、Gly14、Glu16 Ser20和Tyr57)[10]。M基因與CK/HB/4/08株M基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列同源性最高，均為99%；而與A/chicken/Israel/184/2009(H9N2)的核苷酸序列和推導的氨基酸序列同源性最低，分別為93%和94%。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示該分離株M基因與CK/HB/4/08位于同一分支，親緣關系較近。

3 討 論

對流感病毒的研究表明，同亞型HA基因的同源性為80%～100%，不同亞型在68.5%以下[11]。本實驗分離的H9N2亞型SIV的HA基因與CK/HB/4/08的同源性最高為99%，親緣關系很近，可能來源相同。序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明：本實驗分離的SIV與 CK/HB/4/08、A/DK/Hongkong/Y280/97(H9N2)(DK/HK/Y280/97)、 A/Pigeon/Nangchang/2-04612000(H9N2)(Pigeon/NC/2-0461)和 A/Sparrow/Guangxi/1/2005(H9N2)(Sparrow/GX/121/2007)的分離時間和地點不同，但親緣關系很近，表明來自不同宿主的流感病毒可能來源相同，并且無明顯的地域性，這也證實了流感病毒可以跨物種傳播，以及一種新分離株甚至是流行代表株出現(xiàn)后可以迅速擴散和傳播的論點。

HA的裂解位點為PARSSR↓GLF，是典型的低致病性流感病毒的分子特征。其226位氨基酸為Gly，而不是禽源病毒株特征性的Gln[12]。推測是其在適應宿主的過程中產(chǎn)生的變異。而M2基因推導的氨基酸序列的分析結(jié)果顯示其與宿主特異性有關的位點處未發(fā)生變異，均為具有禽流感病毒特異性的氨基酸殘基(Thr11、Gly14、Glu16、Ser20和Tyr57)，進一步表明表面蛋白HA的突變幾率較大，而內(nèi)部蛋白M變異幾率較小。

目前，研究人員已利用BALB/c小鼠進行了H5N1亞型流感病毒的感染、免疫和抗病毒藥物等方面的研究，表明BALB/c小鼠對流感病毒易感，適合作為動物模型[13-14]。因此，本研究進行了H9N2亞型SIV對小鼠的致病性研究，結(jié)果顯示：該病毒株不僅能夠感染小鼠，而且具有較強的致病性；與HA蛋白的裂解位點以及IVPI顯示的低致病性不一致，其原因可能是由于流感病毒在哺乳動物體內(nèi)與在家禽體內(nèi)致病機理不一致。該現(xiàn)象與新型H1N1病毒相似，雖然分析顯示其本身也是一株弱毒株，但在人類某些個體體內(nèi)卻引起致死性感染，SIV對哺乳動物的致病機理還需進一步研究。

分離株SW/HB/0/08的HA、NA、NP和M基因序列分析結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育進化樹均顯示，其與CK/HB/4/08的親緣關系最近，推斷該分離株可能由H9N2亞型AIV進化而來，在跨物種傳播過程中發(fā)生了部分變異。由于SW/HB/0/08對小鼠具有較強的致病作用，可能成為引起人類感染的潛在病毒株之一，因此應加強其對哺乳動物的致病機理的研究。

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