雛鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和莢膜PCR分型

孫翠平，王金良，李書光，趙 蕾，賈 娟，莫 玲，沈志強,*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600)

2010年7月河南某肉鴨場10日齡肉鴨發(fā)生急性、高死亡率疾病，病鴨表現(xiàn)精神沉郁、羽毛松亂、搖頭、急性死亡等癥狀。經(jīng)實驗室診斷疑似鴨肝炎病毒和多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)的混合感染，其中，鴨肝炎病毒感染已經(jīng)被鑒定。

Pm是引起鴨霍亂的病原體，各種年齡的鴨均可以感染，常呈現(xiàn)敗血經(jīng)過，缺乏神經(jīng)癥狀。青年鴨、成年鴨比雛鴨更易感，尤其是3周齡以內的雛鴨很少發(fā)生。鴨肝炎癥狀主要發(fā)生于4日齡～20日齡雛鴨，而成年鴨有抵抗力。

由于Pm莢膜血清型決定病原菌的免疫原性，各血清型之間交叉免疫保護性較低，因此，對致病菌進行莢膜分型尤為重要。按照1984年Carter提出的血清學標準分型方法，以及間接血凝試驗數(shù)據(jù)，將該菌分為A、B、D、E和F 5個莢膜血清型[1]。Townsend等建立了Pm多重PCR分型方法，并得到國內研究者的證實[2-5]。因此，本實驗采用該Pm多重PCR分型方法對鑒定為陽性的Pm進行莢膜血清分型。

本研究通過對病死鴨進行剖檢、肝臟涂片染色、病原分離、生化鑒定、動物試驗及PCR檢測和同源性分析，確定從感染鴨肝炎病毒的10日齡鴨肝臟分離的細菌為A型Pm，與Pm殺禽亞種和多殺亞種親緣關系最近，可能為Pm多殺亞種。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料 Pm C48-1購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由本公司菌毒種室保存；SPF雞購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所；雛鴨購自山東鄒平久久鴨業(yè)有限公司；改良馬丁肉湯、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(配制滅菌后加入5%～10%公綿羊血制成改良馬丁鮮血瓊脂培養(yǎng)基)、麥康凱培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯(BHI)、瓊脂粉、細菌微量生化反應管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 病死鴨剖檢及病原分離 將病死鴨剖檢，肝臟病變部位切面無菌涂片，分別進行革蘭氏、堿性美蘭和瑞氏染色及鏡檢。將肝臟無菌操作分別涂布麥康凱培養(yǎng)基和改良馬丁鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，細菌涂片，分別進行革蘭氏、堿性美蘭和瑞氏染色并鏡檢。

1.3 生化鑒定 將改良馬丁肉湯培養(yǎng)物接種于生化反應管，根據(jù)細菌微量生化反應管使用說明書觀察反應結果。

1.4 病原菌動物試驗

1.4.1 致病性回歸試驗 將分離菌株的改良馬丁肉湯培養(yǎng)物以PBS倍比稀釋，涂布BHI瓊脂平板進行菌落計數(shù)。取10日齡健康肉鴨12只，隨機分為3組。1組～3組分別頸部皮下注射2個～5個、10個～20個和20個～40個活菌；另外設2只健康對照。逐日觀察發(fā)病死亡情況，剖檢觀察組織病變，并將病變部位涂片，分別進行革蘭氏、堿性美蘭和瑞氏染色及鏡檢。

1.4.2 對SPF雞的毒力試驗 將分離菌株與標準菌株C48-1株分別接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，18 h～24 h培養(yǎng)物經(jīng)無菌PBS倍比稀釋后，涂布BHI瓊脂平板進行菌落計數(shù)。取3月齡SPF雞6只，分為3組，每組2只，1組肌肉注射C48-1株2個～5個活菌，2組分別肌肉注射分離菌2個～5個及10個～20個活菌；另外設2只注射PBS對照。逐日觀察發(fā)病死亡情況，并剖檢觀察病變。

1.5 16S rRNA序列測定及同源性分析 以改良馬丁肉湯培養(yǎng)物為模板，PCR反應體系為：雙蒸水35.5 μL、5×Prime Star 緩沖液 10 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、 10 μmol/L 上 下 游 引 物 各 1.0 μL、Prime StarTaqDNA 聚合酶 1.0 μL、模板 0.5 μL。16S rRNA序列PCR擴增反應條件及引物見文獻[6-11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

回收目的條帶，純化后克隆到pMD18-T載體中，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，用KpnⅠ和SphⅠ雙酶切鑒定重組質粒。陽性重組質粒由寶生物工程(大連)有限公司測序，BLAST搜索GenBank中登錄的同源序列，用Clustal W方法進行序列比較分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6kmt1基因和莢膜血清特異性基因的擴增

kmt1基因和莢膜血清特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD的引物和PCR擴增反應條件參考文獻[2]，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結 果

2.1 剖檢變化與病原分離 將病死鴨剖檢可見肝臟有針尖大小壞死灶，存在明顯的出血點和出血斑，其余臟器病變不明顯。染色鏡檢可見肝臟涂片中存在革蘭氏陰性短小桿菌，而美藍和瑞氏染色均見兩極濃染。在麥康凱培養(yǎng)基上無細菌生長，而改良馬丁鮮血瓊脂培養(yǎng)基上有淡灰白色、表面光滑、閃光的露珠狀小菌落，鏡檢菌落涂片為革蘭氏陰性短小桿菌，美藍和瑞氏染色均見兩極濃染。

2.2 生化鑒定結果 將改良馬丁肉湯培養(yǎng)物接種于生化反應管，結果顯示，該株病原菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，排除為鴨疫里氏桿菌的可能性(表1)。結合培養(yǎng)特性及染色特性試驗結果，初步鑒定為Pm。

2.3 病原菌動物試驗

2.3.1 對10日齡肉鴨的致病性回歸試驗結果 將分離菌株的培養(yǎng)物以PBS倍比稀釋，感染實驗鴨，逐日觀察發(fā)病死亡情況可見：1組在感染后45 h～53 h死亡2只，另外2只健活；2組在感染后28 h～36 h全部死亡；3組在感染后12 h～22 h全部死亡；對照組全部健活。對死亡的實驗鴨進行剖檢，可見肝臟表面散布有大量灰白色、針頭大小的壞死灶；腸道尤其是十二指腸呈卡他性和出血性腸炎，腸內容物含有血液。染色鏡檢肝臟和腸內容物涂片均含有革蘭氏陰性短小桿菌，美藍和瑞氏染色均見兩極濃染。

2.3.2 對SPF雞的毒力試驗 將分離菌株與標準菌株C48-1株分別接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，18 h～24 h培養(yǎng)物經(jīng)無菌PBS倍比稀釋后，感染3月齡SPF雞，逐日觀察發(fā)病死亡情況可見：C48-1組于感染后36 h～48 h全部死亡；而分離菌株組在感染后28 h～40 h全部死亡；3組在感染后20 h～28 h全部死亡。對死亡SPF雞剖檢，分離菌株組和C48-1試驗組病死雞均可見一部分雞的腹膜、皮下組織及腹部脂肪有小出血點；心包變厚，心冠脂肪出血尤為明顯；肺臟有充血或出血點；肝表面散布有大量灰白色、針頭大小壞死灶；腸道尤其是十二指腸呈卡他性和出血性腸炎，腸內容物含有血液；一部分雞僅見心外膜有少量出血點；肝臟表面散布有大量灰白色、針頭大的壞死灶。表明分離株與標準株C48-1毒力相近，甚至略強于C48-1的毒力，具有很強的致病力，屬于強致病菌。

2.4 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 對分離株的培養(yǎng)物進行序列測定，結果表明分離株的16S rRNA片段全長為1 504 bp。將分離株的16S rRNA序列用BLAST軟件與GenBank中登錄Pm的16S rRNA序列進行同源性比較，在所得的105個檢索結果中，Pm占92%。將分離株命名為Pm-Y株。選取Query coverage值為100%以及標準菌株的16S rRNA序列，用Clustal W方法分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果可見分離株與已報道的2株Pm殺禽亞種和1株Pm多殺亞種親緣關系最近(圖1)。

表1 病原菌的生化鑒定Table 1 The biochemistry reaction of the bacterial

2.5kmt1基因和莢膜血清特異性基因的擴增結果以改良馬丁肉湯培養(yǎng)的Pm-Y為模板，分別以kmt1+capA、kmt1+capB、kmt1+capD、kmt1+capE、kmt1+capF引物組合，進行PCR擴增。結果可見：僅kmt1+capA引物組同時擴增出小于500 bp以及1 000 bp左右兩條特異條帶，其他組合僅擴增出小于500 bp的一條特異性條帶(圖2)。

2.6 Pm-Y與C48-1株的kmt1基因和莢膜A型血清特異性基因擴增片段比較 C48-1株為A型Pm，以其改良馬丁肉湯培養(yǎng)物為模板，采用kmt1+capA組合引物，經(jīng)PCR擴增所得產(chǎn)物與Pm-Y經(jīng)kmt1+capA組合引物擴增所得的片段進行瓊脂糖電泳比較。結果可見：C48-1也同時擴增出小于500 bp以及1 000 bp左右的兩條特異條帶，與Pm-Y株多重PCR擴增所得的兩條特異性條帶大小一致(圖3)。結合16S rRNA序列測定結果分析可判定Pm-Y為A型Pm。

3 討 論

近年來，關于鴨病毒性肝炎和鴨霍亂混合感染的病例報道多集中于15日齡以上的鴨[12-14]，對細菌病原的鑒定和診斷方法均采用臨床癥狀觀察、剖檢變化、形態(tài)學培養(yǎng)特性觀察和染色鏡檢等傳統(tǒng)的鑒定方法，診斷結果的準確性較低。

本實驗同時采用傳統(tǒng)鑒定方法和分子生物學方法，對分離自患有鴨肝炎10日齡雛鴨的細菌株進行鑒定，結果顯示其為A型Pm。通過16S rRNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌株與Pm多殺亞種和殺禽亞種親緣關系最近。

根據(jù)Pm發(fā)酵山梨醇、阿拉伯糖、木糖和衛(wèi)矛醇的生化反應不同可將其分為3個亞種：多殺亞種、殺禽亞種和敗血亞種。分離株Pm-Y發(fā)酵山梨醇，不發(fā)酵木糖和衛(wèi)矛醇，符合多殺亞種的生化反應特性，而發(fā)酵阿拉伯糖的特點不符合《獸醫(yī)微生物學》第三版的描述。但是，有國外學者認為多殺亞種對阿拉伯糖發(fā)酵是可變的，由此可見，Pm-Y可能屬于Pm多殺亞種。

由發(fā)病鴨年齡可見，雖然鴨肝炎在雛鴨中常見，但Pm病在1月齡以上鴨和產(chǎn)蛋鴨中發(fā)病率較高，10日齡雛鴨不易感，少見發(fā)病，鴨肝炎和巴氏桿菌的混合感染在雛鴨中更是罕見。對10日齡肉鴨的致病性回歸試驗結果顯示，在Pm-Y活菌數(shù)為2個～5個CFU時，只有部分雛鴨死亡，在Pm-Y活菌數(shù)為10個～20個甚至更高時，雛鴨出現(xiàn)急性死亡、死亡率高的情況。養(yǎng)殖場中的雛鴨表現(xiàn)出急性死亡，死亡率高達90%，表明2種病原在雛鴨發(fā)病過程中的主次作用及感染順序有3種可能：首先，在發(fā)病過程中鴨肝炎病毒起主要作用，Pm原為條件性致病菌，在雛鴨感染鴨肝炎病毒發(fā)病、抵抗力差的情況下，導致Pm混合感染，加劇了疫情，增加了死亡率；其次，鴨場內Pm濃度較高，鴨群受到應激(氣溫較高)導致Pm感染，使得雛鴨體質下降，引起鴨肝炎病毒的感染；最后，Pm和鴨肝炎病毒同時感染，導致雛鴨急性、大量死亡。

本次雛鴨鴨肝炎病毒和Pm混合感染也表明目前家禽飼養(yǎng)環(huán)境和疾病感染日趨嚴重，特別是多年連續(xù)飼養(yǎng)的老飼養(yǎng)場，場內致病菌逐年累積，并有逐步返強變異的趨勢，一旦鴨群受到應激(如氣溫較高、多雨潮濕、氣候多變、臺風等)，體質下降就會引起多種病原微生物混合感染?；旌细腥驹斐杉膊〉脑\斷和治療難度加大，多導致急性死亡、高死亡率疫情頻繁發(fā)生。所以，應制定規(guī)范的環(huán)境衛(wèi)生消毒措施，特別要正確處理病死鴨，有條件的飼養(yǎng)場應堅持“全進全出”制，并有適當?shù)目諜谄?，根?jù)當?shù)匾咔橹贫ê侠淼拿庖叱绦颉?/p>

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