甲型H1N1流感病毒株的分離鑒定以及PR8株的相關(guān)基因?qū)χ亟M病毒增殖能力的影響

李建輝，劉春國(guó)，張 云，劉 明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

H1N1亞型流感病毒導(dǎo)致了2009年流感大流行，并造成0.5%的平均死亡率[1]。目前，疫苗免疫是防控流感最有效的措施，因此針對(duì)流行株疫苗的研究是防控流感流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。世界衛(wèi)生組織推薦的方法是“6+2”重配，即以人流感病毒細(xì)胞高產(chǎn)病毒PR8株為骨架提供6個(gè)內(nèi)部基因，外部基因選擇流行株的HA和NA進(jìn)行疫苗的研制[2]。

本研究從某甲型H1N1流感疑似患者的咽喉拭子中分離鑒定出一株甲型H1N1流感病毒，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出基因片段全部來(lái)源于親本甲型H1N1流感的重組病毒株(rLM)，然而按照世界衛(wèi)生組織推薦的方法進(jìn)行“6+2”重配卻未提高重配病毒的產(chǎn)量。將LM株所有片段逐一與PR8株的7個(gè)片段搭配構(gòu)成完整的流感病毒基因組“7+1”重配，比較所得8個(gè)重配病毒的血凝價(jià)，結(jié)果顯示rLM的PB1、PA、HA基因顯著降低了7+1重配病毒的細(xì)胞適應(yīng)性。篩選到了影響rLM株重配病毒細(xì)胞適應(yīng)性的基因，為進(jìn)一步改造其成為細(xì)胞適應(yīng)疫苗株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒分離以及PR8的8質(zhì)粒系統(tǒng) 將2009年10月于哈爾濱某疑似甲型H1N1流感患者的咽喉拭子的浸出液混合雙抗后接種9日齡～11日齡SPF雞胚尿囊腔，37℃培養(yǎng)48 h，4℃冷藏過(guò)夜，收獲尿囊液，分裝于-70℃保存?zhèn)溆?；人流感?xì)胞高產(chǎn)病毒A/PR8/34(H1N1)(PR8)株的8質(zhì)粒系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌種、SPF雞胚以及細(xì)胞系 大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞、293T細(xì)胞和MDCK犬腎細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；9日齡～11日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要試劑 脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；pHW-2000載體由美國(guó)St.Jude兒童醫(yī)院的Webster教授饋贈(zèng)；pMD18-T載體、病毒RNA提取試盒、DNA反轉(zhuǎn)錄試劑禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；TPCK 2trypsin購(gòu)自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶AarⅠ、BsaⅠ和BsmBⅠ購(gòu)自NEB公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自AxyGen公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Unin12：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。參考文獻(xiàn)[3]和文獻(xiàn)[4]由上海英俊生物技術(shù)公司合成擴(kuò)增全基因的引物。

1.5 病毒鑒定、全基因組克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)從含有流感病毒的雞胚尿囊液中提取總RNA，并以Unin-12為引物，按照禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以該cDNA為模板，應(yīng)用各基因相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到8個(gè)帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的片段。膠回收目的片段，分別以各自引物引入的限制性內(nèi)切酶酶切，PCR純化試劑盒純化后與經(jīng)BsmBⅠ酶切的pHW-2000載體進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后經(jīng)菌落PCR鑒定篩選重組質(zhì)粒，并由南京金斯瑞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件拼接后于NCBI中進(jìn)行BLAST檢索，根據(jù)結(jié)果的序列一致性對(duì)分離株進(jìn)行鑒定。并將分離株命名為A/Harbin/LM/2009(H1N1)，簡(jiǎn)稱LM株。

1.6 分離株與PR8株的“7+1”重配病毒以及野生型病毒的拯救 按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，將8個(gè)重組質(zhì)粒各1 μg混合，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。8個(gè)重組質(zhì)粒中7個(gè)來(lái)源于PR8，而由LM株提供第8個(gè)重組質(zhì)粒，進(jìn)行“7+1”基因重配，得到8種排列組合。于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)6 h，棄去轉(zhuǎn)染液，加入含0.5 μg/mL TPCK trypsin的OPTIMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞上清液進(jìn)行血凝活性檢測(cè)，拯救病毒命名為rLM。同時(shí)共轉(zhuǎn)染不含HA片段質(zhì)粒的7個(gè)重組質(zhì)粒為陰性對(duì)照。

1.7 rLM的序列測(cè)定 收獲rLM株第2代雞胚尿囊液，TRIzol法提取總RNA，并以Unin12反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以各基因片段的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物膠回收后連接至pMD18-T載體中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒由南京金斯瑞生物技術(shù)公司測(cè)序。用DNAStar軟件中的SeqMan軟件對(duì)rLM株各基因片段PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與重組質(zhì)粒中病毒基因序列進(jìn)行對(duì)比，確定rLM株序列是否與預(yù)期一致。

1.8 rLM株與親本病毒生物學(xué)特性的比較

1.8.1 病毒血凝(HA)試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液2 000 g離心2 min，經(jīng)尿囊腔接種9日齡～11日齡的SPF雞胚，37℃孵化72 h，收集尿囊液，分裝保存。以0.5%的公雞紅細(xì)胞，按常規(guī)微量法進(jìn)行HA試驗(yàn)。

1.8.2 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將拯救得到的病毒雞胚尿囊液分別用無(wú)菌PBS作10倍系列稀釋，將1∶105和1∶1 010稀釋度的病毒分別接種4枚雞胚(0.2 mL/胚)，37℃孵育48 h后，通過(guò)測(cè)定感染雞胚尿囊液的血凝活性來(lái)判斷是否感染，按照Reed-Muench法計(jì)算EID50值。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR結(jié)果 8個(gè)基因片段的RT-PCR結(jié)果顯示： PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS分別約為 2.3 kb、2.3 kb、2.2 kb、1.7 kb、1.5 kb、1.4 kb、1.0 kb和0.9 kb(圖1)，與預(yù)期的大小相符。

2.2 病毒各片段測(cè)序鑒定與重組質(zhì)粒的鑒定 各節(jié)段PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收處理后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果拼接后于NCBI進(jìn)行BLAST檢索，根據(jù)序列一致性對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示分離株全部基因片段均為2009年3月墨西哥暴發(fā)的甲型H1N1亞型流感病毒。其中NP片段與A/Taiwan/126/2009(H1N1)完全一致，其他片段及一致性最高片段只有1個(gè)～2個(gè)核苷酸的差異，均為沉默突變。BLAST結(jié)果顯示，甲型H1N1流感爆發(fā)一年多后，各地發(fā)表的序列之間以及與較早發(fā)表序列之間的差異較小(表1)。將篩選到含有8個(gè)目的基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示LM株8個(gè)基因片段均克隆到pHW-2000載體中，核苷酸序列與親本株相應(yīng)基因序列結(jié)果完全一致。

2.3 rLM株的拯救 將8個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T和MDCK單層細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，293T細(xì)胞樹(shù)突消失、細(xì)胞皺縮、聚集成團(tuán)塊狀，MDCK細(xì)胞大量崩解；以7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)改變(圖2)。

表1 A/Harbin/LM/2009(H1N1)株序列一致性結(jié)果Table 1 The identification of A/Harbin/LM/2009(H1N1)sequence

2.4 HA試驗(yàn)以及EID50值的測(cè)定 將8個(gè)重配病毒、rLM和野生型H1N1病毒(wH1N1)按常規(guī)方法進(jìn)行HA試驗(yàn)，結(jié)果顯示rLM和野生型H1N1病毒的血凝價(jià)為1∶32，而8個(gè)重配病毒的血凝價(jià)顯示LM株的PB1、PA、HA基因可以降低重配病毒的血凝價(jià)，其中PB1的影響最大(表2)。拯救所得rLM株的 EID50值為 10-6.3EID50/mL，與 wH1N1的 EID50值相近。

表2 A/Harbin/LM/2009(H1N1)與PR8野生型以及“7+1”重配病毒的血凝價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 2 HA titer of wild type PR8 and reassortant type of A/Harbin/LM/2009(H1N1)

3 討 論

本研究拯救一株重組病毒rLM株，其所有基因片段均來(lái)源于親本LM株，并且血凝價(jià)和基因序列與親本病毒株一致。經(jīng)過(guò)與PR8株的7個(gè)其余基因片段進(jìn)行“7+1”重配顯示，PB1、PA和HA基因分別與其余7個(gè)來(lái)源于PR8株的基因發(fā)生重配所產(chǎn)生的重配病毒的血凝價(jià)顯著下降，其中PB1下降最明顯。我們認(rèn)為造成該現(xiàn)象的原因有很多：包裝信號(hào)不兼容性；分別進(jìn)行單基因替換后，PB1和PA與PR8株的相應(yīng)基因組成RNP的效率低下；PR8與LM株的HA和NA不兼容等。本研究將“7+1”重配所得的病毒在MDCK細(xì)胞和雞胚中數(shù)次傳代后，血凝價(jià)并未明顯升高，而將wH1N1和rLM在MDCK細(xì)胞和雞胚的數(shù)次傳代后血凝價(jià)也未明顯升高，其原因還有待進(jìn)一步研究。但是，為了將其改造成具有生產(chǎn)疫苗潛質(zhì)的候選病毒株，必須進(jìn)一步提高病毒的生長(zhǎng)性能。張英偉等2009年通過(guò)將甲型H1N1流感病毒與Vero細(xì)胞高產(chǎn)病毒A/Yunnan/1/2005/Va(H3N2)株共同感染SPF雞胚和Vero細(xì)胞，同時(shí)加入抗H3N2的抗體篩選重配病毒[5]。但該方法需要在前期制備抗體，加入抗體的劑量和條件均需要試驗(yàn)測(cè)定，不利于快速篩選高細(xì)胞適應(yīng)性的疫苗候選株。而鄭薇等2010年通過(guò)將HA和NA的包裝信號(hào)替換為骨架病毒株原來(lái)的HA和NA的包裝信號(hào)的策略，使“6+2”重配產(chǎn)生的疫苗候選株中NA基因的包裝效率得到完全恢復(fù)，并且重配病毒在雞胚的生長(zhǎng)滴度也提高了10倍，HA含量提高了約2.7倍[6]。

本研究中采用“7+1”重配方式產(chǎn)生的重配病毒在細(xì)胞中生長(zhǎng)性能的差別顯示出流感病毒對(duì)于細(xì)胞的適應(yīng)性是由多個(gè)基因?qū)е碌模液芸赡苁怯捎诎b信號(hào)和病毒基因自身特性造成。當(dāng)以高產(chǎn)病毒株的內(nèi)部基因?yàn)楣羌苓M(jìn)行“6+2”重配產(chǎn)生的重配病毒的生長(zhǎng)性能仍然較差時(shí)，如何提高疫苗候選株的生長(zhǎng)性能還需要進(jìn)一步研究。

[1]Michael G,Ison M D.Influenza 2010-2011:Lessons from the 2009 pandemic[J].Clevel Clin J Med.2010,77(11):812-820.

[2]Webby R J,Perez D R,Coleman J S,et al.Responsiveness to a pandemic alert:Use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines[J].The Lancet,2004,363(9415):1099-1103.

[3]Liu Ming,Wood J M,Elis T,et al.Preparation of a standardized efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics[J].Virology,2003,314:580-590.

[4]劉明，張?jiān)?，劉春?guó)，等.利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建H5亞型禽流感高產(chǎn)疫苗株[J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22(5)：720-726.

[5]張英偉，李衛(wèi)東，馬娜，等.以重配技術(shù)制備H1N1流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009，22(6)：529-532.

[6]鄭薇，潘蔚綺，楊化強(qiáng)，等.A/PR8/34(H1N1)NA基因包裝信號(hào)對(duì)H5N1流感疫苗株NIBRG 214產(chǎn)量的影響[J].中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，40(4)：331-338.