同時檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒和偽狂犬病毒連接酶檢測反應(yīng)-PCR基因芯片檢測方法的建立

郭 瑤，汪 平，董沁芳，程菊會，徐 輝，丁先鋒，郭江峰，姜永厚*

(1.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州310018；2.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州310020)

GUO Yao1,WANG Ping1,DONG Qin-fang1,CHENG Ju-hui1,XU Hui2,DING Xian-feng1,GUO Jiang-feng1,JIANG Yong-hou1*

(1.College of Life Sciences,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China;2.Centre of Animal Diesase Control of Zhejiang Province,Hangzhou 310020,China)

豬圓環(huán)病毒 2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)在臨床上易與其它病原混合感染引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)等疾病[1]。PCV在世界各國豬群中廣泛存在，臨床上易與其它病原混合感染。豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)能夠引起母豬繁殖障礙，導致的臨床癥狀為母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等[2]。豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由PR病毒(PRV)引起的傳染性疾病，臨床癥狀為母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔及木乃伊胎等[3]。該病在豬群中具有死亡率高、傳播速度快、流行范圍廣等特點[4]。上述3種豬病毒引起的疾病癥狀相似并且常呈混合感染，因此建立快速有效地檢測手段，對制定切實可行的疫病防制措施具有重要意義。

連接酶檢測反應(yīng)(LDR)是利用耐熱DNA連接酶的特異性，在探針與目的DNA互補配對后，連接酶通過催化磷酸二酯鍵將相鄰的兩個探針連接，當探針的接頭處存在堿基錯配時，連接反應(yīng)便不能夠進行[5]。LDR技術(shù)具有特異性高、通用性好、適用范圍廣等特點，通過整合其它技術(shù)，在生物分子檢測中取得了更大進展[6]?；蛐酒夹g(shù)是伴隨著人類基因組計劃的實施而發(fā)展起來的前沿生物技術(shù)，基本原理是利用反向固相雜交技術(shù)，將標記的樣品分子與微點陣上的核酸探針雜交，實現(xiàn)多至數(shù)萬個分子間的雜交反應(yīng)，但靈敏度不高[7]。許多方法將多重PCR與芯片雜交結(jié)合起來提高檢測的靈敏度，但對引物設(shè)計要求較高，限制了檢測通量[8]。本研究將LDR-PCR與基因芯片技術(shù)結(jié)合，首次建立了快速、靈敏并能夠同時檢測PCV2、PPV和PRV 3種病毒的LDR-PCR基因芯片方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和臨床樣本 PCV2和PCV1參考株由浙江大學周繼勇教授饋贈；PPV、PRV、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)疫苗由北京中海保健科技公司提供；牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)購自中國獸藥監(jiān)察所；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)二聯(lián)凍干活疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)公司；乙型腦炎病毒(JEV)疫苗由武漢科前動物生物制品有限公司提供；41例本實驗室保存的臨床樣本包括淋巴結(jié)、脾、肺和扁桃體，采集于表現(xiàn)繁殖障礙或呼吸障礙癥狀的仔豬和流產(chǎn)胎兒。

1.2 主要試劑和儀器TaqDNA聚合酶、pUCm-T載體及鮭魚精DNA購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TaqDNA連接酶購自英國NEB公司；Cy5-dCTP購自英國GE Healthcare公司；醛基芯片、雜交Buffer購自上海百傲科技有限公司；DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自TaKaRa公司；芯片點樣儀為美國BioDot公司產(chǎn)品；GenePix 4000掃描儀為美國Axon公司產(chǎn)品。

1.3 探針及引物設(shè)計 每對探針由5段序列組成，從5'到3'依次為：上游通用序列、上游病毒特異序列、下游病毒特異序列、Zip-code序列、下游通用序列。根據(jù)GenBank中登錄的序列，應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計引物和LDR探針(表1和表2)。根據(jù)文獻[9]選擇設(shè)計一組通用引物序列和12個Zip-code序列(表1和表3)。其中3個Zip-code為目的位點，1個為馬鈴薯18S rRNA陽性對照，其它8個為陰性對照位點。探針和引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 核酸提取 采用RNA或DNA抽提試劑盒從細胞株、新鮮或冷凍的組織樣本中提取病毒核酸。

1.5 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系包括2 μL病毒DNA或 cDNA、每種引物 0.2 μM、1×PCR buffer[100 mM Tris-HCl(pH8.8)、 500 mM KCl、 0.8%NP-40]、2 mM MgCl2、0.05 mM dNTP、1.25 UTaq酶。PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃3 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)； 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢察擴增片段的大小。

表1 引物序列和通用引物序列Table 1 Primers for 3 swine viruses,18S rRNA and the universal primers

表2 LDR探針序列Table 2 Sequences of LDR probes

表3 Zip-code序列及其芯片上的位置Table 3 Zip-code sequences and coordinate in the array

1.6 模板質(zhì)粒的構(gòu)建 將單一病毒擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后分別克隆至pUCm-T載體中，以質(zhì)粒抽提試劑盒進行提取。重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR和DNA測序驗證。用超微量核酸分光光度計測定重組質(zhì)粒的濃度。

1.7 多重LDR反應(yīng) 以構(gòu)建的重組質(zhì)?；虿《綝NA/cDNA為模板，進行LDR連接，對LDR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2 μM上、下游探針各 1.0 μL、1 UTaqDNA 連接酶(40 U/μL)、重組質(zhì)粒 或 病 毒 DNA/cDNA 2.0 μL、10×LDR Buffer 1.0 μL、ddH2O補齊至10 μL。反應(yīng)條件：94℃3 min；94℃30 s、60℃4min，10個循環(huán)。

1.8 不對稱熒光標記PCR 以多重LDR產(chǎn)物為模板，總體積25 μL的不對稱PCR反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2.5 μL、25 mM MgCl22.0 μL、上游通用引物(2.5 μM)和下游通用引物(25 μM)各 0.5 μL、2.5 mM dNTP 2.0 μL、 25 μM Cy5-dCTP 4.0 μL、TaqDNA聚合酶1.25 U、LDR連接產(chǎn)物1.0 μL。反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃30 s、50℃30 s、72℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后，3%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物。另外，以Cy5標記的引物進行相同體系和條件的不對稱熒光標記PCR反應(yīng)，比較兩種標記物反應(yīng)的靈敏度。

1.9 通用芯片的制備 依據(jù)點樣數(shù)量，確定探針在點陣圖中的位置，每條探針重復(fù)3次。同時設(shè)立陽性對照和陰性對照(表3)。將合成的探針溶于3×SSC溶液內(nèi)，終濃度為20 μmol/L，置于384孔板內(nèi)，采用BioDot點樣儀按照預(yù)先設(shè)定的點陣序列，調(diào)整點樣參數(shù)，將探針溶液點到醛基化玻片上。點樣后室溫、75%濕度下水合2 h，80℃烘箱中干燥20 min，固化寡核苷酸。

1.10 雜交及數(shù)據(jù)分析 在點制的芯片上加入變性的預(yù)雜交液 10 μL(9 μL 雜交 Buffer和 1 μL 鮭魚精DNA)，加蓋于42℃烘箱中預(yù)雜交0.5 h。取出玻片，分別于洗液Ⅰ(0.1×SSC，1%SDS)和洗液Ⅱ(0.1×SSC)中各洗滌5 min，吹干芯片。向濃縮后的標記 PCR產(chǎn)物中加入 8 μL雜交 Buffer和 2 μL 18S rRNA標記產(chǎn)物，95℃變性5 min，冰上冷卻5 min后加于預(yù)雜交的玻片上，加蓋于42℃避光雜交1 h～2 h。取出芯片分別于洗液Ⅲ(0.2×SSC，2%SDS)、洗液Ⅰ(0.1×SSC，1%SDS)、洗液Ⅱ(0.1×SSC)中洗滌5 min。吹干并進行芯片掃描，掃描結(jié)果以GenePix Pro 5.0軟件進行分析。當探針熒光強度值大于1 000，并且信噪比SNR(探針熒光強度值/局部背景熒光強度值)大于1.5時，判定為陽性。

1.11 特異性試驗 將 BVDV、TGEV、PEDV、PRRSV、CSFV和JEV同時提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，對PCV1提取DNA，同時進行擴增、標記和芯片雜交。

2 結(jié) 果

2.1 LDR-PCR芯片雜交方法的特異性 分別以單一和混合重組質(zhì)粒為模板，LDR反應(yīng)體系中混合3種探針，連接后標記擴增，芯片雜交。結(jié)果表明，本研究建立的方法特異性良好，PCV2、PPV和PRV的檢測結(jié)果均為陽性，呈現(xiàn)紅色的熒光信號，陰性對照探針無陽性信號；而對非靶標病毒，如BVDV、TGEV、PEDV、PRRSV、CSFV、JEV 和PCV1幾種主要的豬病病毒均呈陰性反應(yīng)(圖1)。

2.2 Cy5-dCTP標記方法和引物標記方法的靈敏度將PCV2重組質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，選擇105拷貝～0拷貝的重組質(zhì)粒為模板，在不對稱PCR中加入Cy5-dCTP標記，進行芯片雜交。結(jié)果表明，隨著模板濃度的降低，目的位點雜交信號減弱，1拷貝時仍產(chǎn)生微弱信號，因此，該標記方法的檢測靈敏度為10拷貝(圖2)。

同時以相同的LDR產(chǎn)物為模板，不對稱PCR中加入Cy5標記引物，芯片雜交。隨著模板濃度的降低，雜交信號減弱，1拷貝時無信號，各濃度下雜交信號強度低于Cy5-dCTP標記結(jié)果(圖2)。

2.3 臨床樣品的檢測 利用多重LDR-PCR基因芯片方法對41例臨床樣品進行檢測，同時進行普通PCR檢測，對兩種方法的檢測結(jié)果進行比較(表4)。本研究建立的方法與普通PCR檢測結(jié)果符合率為97.6%～100%。該方法檢出感染PCV2的樣品9例；感染PPV的14例；同時感染兩種病毒的樣品3例，未檢出PRV感染；檢出普通PCR陰性而本方法陽性的樣品2例。

表4 LDR-PCR芯片雜交方法和PCR方法檢測臨床樣品Table 4 Clinical samples detection by the LDR-PCR microarray and conventional PCR

3 討 論

目前，檢測低含量病原體的方法較多，但在靈敏度、特異性、耗資和耗時等方面存在差異。本研究在LDR-PCR方法的基礎(chǔ)上結(jié)合基因芯片技術(shù)，提高檢測的靈敏度，可以在早期準確地檢測病原，這對于預(yù)防、控制疫情的蔓延十分重要。通過分子雜交的方法，有效克服了PCR易污染的缺點，克服了ELISA法和IFA法敏感性差和需要制備新鮮紅細胞的問題[10]。

探針和引物設(shè)計是本實驗的基礎(chǔ)。PCV1和PCV2的序列差異主要存在于ORF2基因，因此本研究針對PCV2的ORF2序列設(shè)計一組LDR探針，能夠特異性地檢測PCV2，有效地與PCV1進行區(qū)分。另外，本研究選擇設(shè)計一對通用引物序列和12條Zip-code序列，其中3條Zip-code對應(yīng)目的位點，1條為馬鈴薯18S rRNA陽性對照，其它8條為陰性對照。文獻報道的探針序列中大多含有cZip-code，與玻片上的Zip-code互補[9]。本研究對LDR探針序列進行改進，選擇與玻片上序列相同的Zip-code，這樣即使探針沒有完全用于連接，剩余探針也不會結(jié)合到玻片對應(yīng)位點，影響連接產(chǎn)物與探針雜交，從而降低雜交效率。3組探針均有相同的通用序列，通過一次PCR可以獲得3種病毒的連接產(chǎn)物，有利于多重反應(yīng)，為下一步芯片雜交奠定基礎(chǔ)。

由于LDR是線性擴增，產(chǎn)物不易檢測，LDR后采用不對稱PCR技術(shù)，標記并制備單鏈熒光標記產(chǎn)物用于雜交，有利于提高雜交的特異性和靈敏度[11]。通過試驗確定引物比例為10∶1時雜交信號較好。我們在雜交環(huán)節(jié)中選擇通用芯片，玻片上的Zip-code探針序列并不與特異性的序列分析直接關(guān)聯(lián)，而可以連接到任何一組LDR特異性探針上，這種通用性具有較大的自由度，無需對每一種探針的雜交條件進行單獨優(yōu)化。

本研究比較了引物標記和Cy5-dCTP標記兩種方法。理論上，引物標記對每條連接產(chǎn)物進行末端標記，而Cy5可以對產(chǎn)物中多個dCTP進行標記，產(chǎn)物的標記分子數(shù)遠高于引物標記；試驗結(jié)果也表明，引物標記方法的靈敏度為10拷貝，1拷貝時無信號，而Cy5-dCTP標記方法在1拷貝時仍產(chǎn)生微弱信號，并且整體信號強度值顯著高于引物標記方法。因此Cy5-dCTP標記方法檢測靈敏度優(yōu)于引物標記方法。

姜永厚等利用多重PCR方法對76例臨床樣品中4種豬病毒進行檢測，檢出混合感染樣品26例，檢出率為34.2%[12]。Kim對混合感染PCV1、PCV2和PPV的臨床樣本進行檢測，多重PCR方法檢測出同時感染3種病毒的臨床樣品5例[13]。通過對臨床樣本的檢測，本研究建立的LDR-PCR芯片雜交方法的特異性良好，靈敏度較高。部分PCR檢測呈陰性的樣品通過該方法檢測為陽性，準確性高于PCR方法。實驗結(jié)果表明所采集樣品以單一感染為主，但也存在混合感染。該方法能夠一次性檢出混合感染的多種靶標豬病毒，其較高的靈敏度能夠更準確地對樣本進行早期檢測，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。

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