豬圓環(huán)病毒2型對仔豬淋巴細胞內(nèi)cAMP和cGMP的影響

華利忠，張書霞，陳 耿，孫 運，代 蕾，呂春子

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circuvirousⅡ，PCV2)能夠引起感染仔豬的免疫抑制[1]。關(guān)于免疫抑制的機理雖然國內(nèi)外已有許多報道，但多集中在病理變化[2]、細胞亞群[3-4]及細胞因子[5-7]等的變化方面，至于單個免疫細胞功能的變化并不多見。研究表明大量缺失的淋巴細胞及浸潤的巨噬細胞是PCV2感染變化最明顯的兩類免疫細胞，其中淋巴細胞數(shù)量的減少是免疫抑制的關(guān)鍵[8]。然而，PCV2能否通過降低單個淋巴細胞的免疫功能導(dǎo)致感染仔豬的免疫抑制目前尚未見報道。

胞內(nèi)第二信使cAMP、cGMP是細胞內(nèi)信息傳遞過程中一對作用相反而又相互制約的生物化學(xué)分子，是細胞功能的重要調(diào)節(jié)物，具有調(diào)節(jié)炎癥及免疫等多方面功能，其作用的發(fā)揮與兩者比值有關(guān)[9]。cAMP是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，淋巴細胞的多種功能如細胞的激活與增殖、細胞毒活性、細胞因子的產(chǎn)生以及抗體的形成等均與細胞內(nèi)cAMP含量變化有關(guān)。cAMP水平升高可抑制淋巴細胞的增殖，促進淋巴細胞的分化；反之，cAMP水平降低可以促進淋巴細胞的增殖，抑制其分化[10]。

陳耿等對PCV2感染仔豬血清中IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10的表達變化進行研究，結(jié)果顯示PCV2可以引起仔豬適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化出現(xiàn)遲滯并在攻毒后期引起免疫調(diào)節(jié)紊亂[11]。本實驗在此基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)、外試驗，測定仔豬脾臟細胞內(nèi)cAMP和cGMP濃度及其比值的變化，以進一步探討PCV2致感染仔豬免疫抑制的機理。

1 材料和方法

1.1 病毒株 PCV2病毒(PCV2-SH株)懸液由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室提供。根據(jù)文獻[12]的方法增殖，病毒懸液通過PCR及間接免疫熒光試驗(IFA)測定，病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為5×105TCID50/mL。

1.2 主要實驗材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清分別購自Gibco公司和杭州四季青生物公司；125I-cAMP/125I-cGMP放射免疫分析藥盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)；考馬斯亮藍檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；FMJ2182型γ計數(shù)器購自中科院上海原子能研究所。

1.3 體外試驗 5頭35日齡經(jīng)ELISA檢測血清PCV2以及豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)抗體陰性仔豬，隔離飼喂3 d，待消除應(yīng)激后作為實驗動物。試驗時豬頸靜脈放血致死，無菌摘除脾臟，根據(jù)文獻[13]的方法機械法分離脾細胞，調(diào)整細胞數(shù)(2×107cells/mL)，250 mL培養(yǎng)瓶于37℃5%(v/v)CO2中培養(yǎng)2 h，收集懸浮細胞作為脾臟淋巴細胞備用，保留貼壁的細胞于原瓶中即為脾臟巨噬細胞(Macrophage，Mφ)。

將收集到的淋巴細胞經(jīng)兩次PBS漂洗后懸浮于含10%小牛血清的RPMI-1640中，使其含量為6×106cells/mL。將所有淋巴細胞平均分為兩組：實驗組和對照組。實驗組每毫升細胞懸液中加入PCV2病毒懸液200 μL，對照組加等量的RPMI-1640混勻，使淋巴細胞終含量為5×106cells/mL。將各組淋巴細胞再分為兩份，其中一份轉(zhuǎn)移到各自的原瓶中(含Mφ)作為與巨噬細胞共培養(yǎng)的淋巴細胞組(Mφ)和與巨噬細胞共培養(yǎng)的淋巴細胞接種病毒組(PCV2＋Mφ)，另一份置于新的培養(yǎng)瓶中，作為單獨淋巴細胞組(Control)和單獨淋巴細胞接種病毒組(PCV2)。所有細胞于37℃ 5%CO2分別培養(yǎng)0 h、6 h、12 h 和 24 h(Hours post-inoculation，HPI)后收取懸浮的淋巴細胞，經(jīng)PBS漂洗兩次，液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 體內(nèi)試驗 5周齡經(jīng)ELISA法檢測血清PCV2、PRRSV和偽狂犬病病毒(PRV)陰性，并經(jīng)PCR檢測PCV2血清抗原陰性的普通斷奶仔豬19頭，隨機分為4組，3個試驗組每組各5頭，每頭滴鼻接種劑量為5×105TCID50/mL PCV2病毒懸液4 mL，對照豬4頭，每頭滴鼻相同體積PBS。試驗期間，觀察受試豬臨床癥狀并記錄體溫變化，分別于14 d、21 d、35 d迫殺。取全血常規(guī)分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?；迫殺后立即取脾臟液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒血癥的檢測 取各試驗豬血清及陰性對照(接種PK-15細胞懸液)和陽性對照(接種PCV2的PK-15細胞病毒懸液)樣品各500 μL，按文獻[12]的方法提取血清DNA，用PCV2特異性引物進行PCR檢測。PCV2的引物序列為：PCV2.1：5'-TTCGGT ACCAGCTATGACGTATCCAAG-3'； PCV2.2： 5'-GC CAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3'，由英俊生物技術(shù)有限公司合成。預(yù)期擴增片段大小為751 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL，PCR反應(yīng)條件為95℃5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.6 血清抗體滴度的檢測 根據(jù)文獻[12]和[14]的方法，采用ELISA法檢測血清中抗體滴度。結(jié)果判定：①待檢血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值≥2.1判為陽性；②用待測血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值的差值，統(tǒng)計4個試驗組豬各自抗體滴度的差異。

1.7 細胞內(nèi)cAMP和cGMP含量的檢測 體外培養(yǎng)淋巴細胞，取約5×106個細胞加1 mL 50 mmol/L(pH4.7)的醋酸緩沖液，混懸，反復(fù)凍融4次以裂解細胞，離心取上清。按考馬斯亮藍操作說明測定上清蛋白濃度。然后取上清液500 μL按照125I-cAMP及125I-cGMP放射免疫分析藥盒說明書進行cAMP、cGMP含量測定，根據(jù)γ計數(shù)器直接給出有關(guān)參數(shù)、標準曲線及樣品濃度，以每毫克上清蛋白中含有cAMP摩爾數(shù)(pmol/mg pro)和cGMP摩爾數(shù)(fmol/mg pro)表示。

體內(nèi)試驗取脾臟組織50 mg左右，按照125I-cAMP及125I-cGMP放射免疫分析藥盒說明書進行cAMP、cGMP含量的測定，由γ計數(shù)器直接給出有關(guān)參數(shù)、標準曲線及樣品濃度。最后以每毫克組織中cAMP和cGMP的摩爾數(shù)表示其濃度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用方差分析的新復(fù)極差法(Duncan法)對各試驗組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2病毒血癥檢測結(jié)果 試驗組仔豬接種病毒后7 d平均體溫40.2℃。接種后抽取部分不同時期感染仔豬血清中均能檢測到PCV2核酸(圖1)，即接種病毒組仔豬均出現(xiàn)了PCV2病毒血癥；而對照組及陰性對照均未能檢測到PCV2核酸。

2.2 血清抗體水平檢測結(jié)果 用ELISA法檢測PCV2血清抗體滴度的結(jié)果顯示，4個對照豬血清PCV2抗體均為陰性，而15個試驗豬均為陽性。4個組的平均OD值分別為 0.003±0.007、0.367±0.175、0.587±0.170、0.558±0.192，統(tǒng)計學(xué)分析顯示14 d時相比對照組極顯著上升(p<0.01)，21 d和35 d時抗體水平相比其他兩組極顯著上升(p<0.01)。

2.3 PCV2對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細胞內(nèi)cAMP和cGMP含量的影響 體外培養(yǎng)仔豬淋巴細胞內(nèi)cAMP和cGMP的含量變化見圖2，PCV2作用6 h后，細胞內(nèi)cAMP含量在對照組和PCV2組均顯著高于 Mφ 和 PCV2+Mφ 組(p<0.05)；cGMP濃度，在6 h和12 h時Mφ和PCV2+Mφ組顯著低于對照組和PCV2組(p<0.05)，但24 h時高于對照組(p<0.05)。cAMP/cGMP比值，Mφ和PCV2+Mφ組在6 h和24 h時相比對照組顯著下降(p<0.05)，但12 h時Mφ和PCV2+Mφ組相比對照組和PCV2組顯著上升(p<0.05)。PCV2組和PCV2+Mφ組在所測時間點上與對應(yīng)的對照組或Mφ無明顯差異(p<0.05)。

2.4 PCV2對仔豬脾臟細胞內(nèi)cAMP及cGMP含量的影響 PCV2感染仔豬脾臟細胞內(nèi)cAMP和cGMP濃度及其比值的變化(表1)。結(jié)果顯示，隨著病毒接種時間的延長，脾臟細胞內(nèi)cAMP的含量逐漸降低(p<0.01)，但3個病毒接種組之間比較差異不顯著(p>0.05)。cGMP含量，3個病毒接種組相比對照組差異均不顯著(p>0.05)，但病毒接種后21 d時cGMP含量顯著高于病毒接種后14 d時的含量(p<0.05)。cAMP/cGMP比值在14 d時相比對照組差異不顯著(p>0.05)，但在21 d和35 d時相比對照組極顯著下降(p<0.01)。上述結(jié)果與體外試驗結(jié)果趨勢一致，表明PCV2確實能夠下調(diào)脾臟細胞cAMP/cGMP的比值，從而影響淋巴細胞的免疫功能。

表1 PCV2感染仔豬脾臟細胞內(nèi)cAMP和cGMP含量及cAMP/cGMP比值的變化Table 1 The changes of cAMP and cGMP concentration and cAMP/cGMP ratio in porcine lymphocytes infected by PCV2(±SD)

3 討 論

cAMP、cGMP作為細胞內(nèi)的第二信使調(diào)節(jié)著細胞的某些生命活動，也是調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫功能及凋亡的重要生物化學(xué)分子。要維持體內(nèi)細胞的正常代謝，組織細胞中cAMP、cGMP的濃度必須保持在恒定的范圍之內(nèi)，若比例發(fā)生改變(偏高或降低)將會引起細胞功能失調(diào)而導(dǎo)致疾病[15-16]。本實驗發(fā)現(xiàn)單獨的PCV2并不影響體外培養(yǎng)仔豬淋巴細胞內(nèi)cAMP和cGMP的濃度，但當PCV2與巨噬細胞聯(lián)合作用時對淋巴細胞內(nèi)cAMP和cGMP的濃度即會產(chǎn)生明顯的影響。在PCV2作用6 h時，能夠降低cAMP和cGMP的濃度和比值，24 h時雖然cGMP的含量有所升高，但cAMP/cGMP的比值依然顯著低于空白對照組，這些都表明PCV2和巨噬細胞共同作用后，可以通過下調(diào)cAMP/cGMP的比值從而降低淋巴細胞的活性，使淋巴細胞的免疫功能下降。我們猜測，臨床上感染PCV2仔豬的免疫器官中可能因為感染PCV2的巨噬細胞大量浸潤而顯著影響淋巴細胞內(nèi)cAMP/cGMP的比值，降低其免疫功能，使感染仔豬發(fā)生免疫抑制。因為，研究發(fā)現(xiàn)PCV2主要存在于巨噬細胞和組織細胞中，淋巴細胞中極少被檢測到[17]，所以，一旦PCV2感染的巨噬細胞浸潤免疫器官，就可能改變淋巴細胞內(nèi)cAMP/cGMP的比值，從而影響其活性及免疫功能。

為進一步證實上述推測，我們進行了體內(nèi)試驗，測定了PCV2感染仔豬脾臟細胞內(nèi)cAMP和cGMP濃度及其比值。結(jié)果顯示，PCV2感染仔豬脾臟中cAMP顯著下降，cAMP/cGMP比值也顯著下降，表明PCV2確實能夠通過下調(diào)淋巴細胞內(nèi)cAMP/cGMP的比值從而影響淋巴細胞的免疫功能。因為cAMP的升高能夠增強淋巴細胞的免疫功能[18]及機體非特異性免疫功能[19]，其含量的下降表明淋巴細胞及機體的免疫功能也隨之下降[20]，抗病毒能力也隨之下降[21]，這也許是PCV2感染造成仔豬免疫抑制的原因之一。另外有研究顯示cAMP還具有保護細胞的作用，顧洛等在大鼠注射消炎痛和失血性休克后，檢測胃組織cAMP含量的變化和胃黏膜損害之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著全胃組織cAMP含量的降低，胃黏膜損害明顯加重[22]。cAMP的下降也許是PCV2致脾臟組織損傷的原因之一。

PCV2可以通過巨噬細胞的介導(dǎo)降低淋巴細胞內(nèi)cAMP/cGMP的比值，從而影響淋巴細胞的免疫功能。

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