H5N1亞型禽流感病毒低劑量感染小鼠發(fā)病模型的建立

李旭勇，郭 晶，施建忠，李雁冰，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001)

H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)自2003年以來已在60多個國家和地區(qū)的家禽和野鳥中引起禽流感暴發(fā)，并在15個國家導(dǎo)致500多人感染，人的病死率近60%。

近年在H5N1亞型AIV進化、致病力分子機制及水平傳播分子機制等方面取得了一系列的進展[1-3]。但有關(guān)病毒-宿主相互作用的致病機制仍未得到充分闡明。小鼠感染模型被廣泛應(yīng)用于季節(jié)性流感病毒發(fā)病機制的研究[4-5]。能夠感染并致死人類的禽源H5N1高致病性流感病毒株往往對小鼠也表現(xiàn)為高度致死性[6]。目前的研究一般采用較大的病毒劑量感染小鼠，導(dǎo)致病毒在肺、腦等關(guān)鍵器官因病毒滴度快速升高，迅速致死動物[7-9]。然而，哺乳動物特別是人類自然感染時，一般只有微量病毒進入體內(nèi)，病毒在體內(nèi)復(fù)制及病理損傷進程往往持續(xù)2周～3周，最后才導(dǎo)致臨床死亡[10-11]。為此，我們采用對哺乳動物和小鼠均具有高度致病力和致死性的候鳥分離病毒株A/bar-headed goose/Qinghai/3/05(BHG/3/05)[12]，通過低劑量接種方式，建立了體內(nèi)病毒復(fù)制動態(tài)、組織分布、病理損傷進程更加接近人類自然感染H5N1高致病性AIV發(fā)病進程的小鼠感染模型，為探討人類感染H5N1高致病性AIV的病理發(fā)生機制提供了具有價值的動物感染模型。

1 材料和方法

1.1 病毒株 H5N1亞型AIV A/bar-headed goose/Qinghai/3/05(BHG/3/05)分離自野鳥斑頭雁，是引起2005年我國青海湖野鳥禽流感暴發(fā)的H5N1亞型AIV之一[12]。病毒接種9日齡～10日齡雞胚，37℃溫箱中孵育24 h～36 h，收取尿囊液，按OIE推薦方法測定血凝價為8.0 log2～9.0 log2雞胚半數(shù)感染量(EID50)，分裝保存于-70℃冰箱中備用。所有涉及H5N1高致病性AIV的操作均在生物安全3級實驗室中進行。

1.2 動物實驗 6周齡雌性BALB/c小鼠(購自北京維通利華公司)40只，隨機分為兩組，第一組5只，第二組35只。所有小鼠分別經(jīng)CO2輕度麻醉后，通過鼻腔接種100.4EID50的病毒液。第一組感染病毒后每天稱量計算平均體質(zhì)量并觀察發(fā)病與存活情況。第二組分別于感染后第3 d、5 d、7 d、10 d、14 d，隨機抽取3只存活小鼠，經(jīng)CO2麻醉后剖殺，采集腦、鼻甲、脾臟、腎臟、肺臟等器官，按照文獻[6]方法分別進行病毒含量的滴定；同時分別于感染后的第3 d、7 d、10 d，隨機選取3只小鼠剖殺，采集肺、腦和脾臟，進行組織病理學(xué)檢查。

1.3 病理組織學(xué)檢查 小鼠腦、脾臟、肺臟分別經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后，按常規(guī)包埋，制備石蠟切片，HE染色后鏡檢。同時利用A型流感病毒NP單克隆抗體，采用免疫組化試劑盒，按照說明書進行組織切片的免疫組化染色，檢測腦、脾臟、肺臟組織細胞中的病毒抗原。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的發(fā)病和死亡情況 小鼠在接種100.4EID50劑量的BHG/3/05 2 d后，體質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢(圖1A)；一周后小鼠開始出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為食欲下降、呼吸急促、共濟失調(diào)、顫抖、運動遲緩等癥狀。有40%的小鼠在持續(xù)2周的觀察期內(nèi)死亡，耐過的小鼠大多表現(xiàn)出輕微的神經(jīng)癥狀(圖1B)。結(jié)果表明，即使極小劑量的BHG/3/05病毒感染后仍可導(dǎo)致一部分的小鼠死亡，這與以前的研究報告中BHG/3/05對小鼠的半數(shù)致死量(MLD50)小于100.5EID50一致[12]。

2.2 病毒在體內(nèi)的復(fù)制與擴散 病毒感染后第3 d、5 d、7 d、10 d及14 d，分別迫殺3只小鼠，取其鼻甲、肺臟、脾臟、腎臟和腦等器官進行病毒滴定。結(jié)果顯示感染后第3 d，除鼻甲和肺臟，其他臟器中均未檢測到病毒。感染后第5 d、7 d和第10 d，所有被檢的臟器中都檢測到了病毒。鼻甲中的病毒滴度以第3 d為最高；肺臟中的病毒在感染后第5 d、7 d、10 d均維持在一個較高水平；脾臟中的病毒滴度以感染后第5 d為最高；腦和腎臟中的病毒滴度分別在第7 d達到最高。感染后第14 d，所有被檢器官中均未檢測到病毒(圖2)。

2.3 組織病理學(xué)變化 組織病理學(xué)檢查顯示，感染后第3 d的肺臟以充血、滲出為主，至第10 d發(fā)展為典型的間質(zhì)性肺炎；感染后第5 d和第10 d。脾臟變化主要表現(xiàn)為濾泡中淋巴細胞的大量丟失，腦組織中的病理變化主要表現(xiàn)為非化膿性腦炎(圖3)。同時，免疫組化染色分別在感染后第7 d，剖殺小鼠的肺、脾和腦組織中檢測到流感病毒抗原(圖4)。

3 討 論

BALB/c小鼠是流感病毒研究中使用最為廣泛的哺乳動物模型，一般的季節(jié)性流感病毒接種小鼠后，病毒復(fù)制多局限于呼吸道，5 d～7 d后被免疫系統(tǒng)清除[13-14]。而H5N1亞型高致病性AIV感染后可能導(dǎo)致全身感染，并迅速致死。研究發(fā)現(xiàn)2005年引起青海湖野鳥禽流感暴發(fā)的H5N1亞型病毒對小鼠的致病力呈多樣性，其中BHG/3/05株中對小鼠呈高致病力(小鼠半數(shù)致死量小于100.5EID50)。采用高劑量(106EID50)的BHG/3/05接種小鼠后，第3 d可在多個器官中檢測到該病毒[12]，接種后第6 d～8 d所有小鼠死于感染。當用低劑量(100.4EID50)感染小鼠后，第3 d僅在鼻腔和肺臟中檢測到該病毒。但病毒并未被局限在呼吸系統(tǒng)或被清除，而是隨時間推移逐漸侵入多個臟器；接種后第7 d，腦和腎臟中的病毒滴度達到峰值；感染后小鼠的體質(zhì)量持續(xù)下降，病癥逐漸加重，至第9 d開始死亡。結(jié)果表明，低劑量感染條件下，病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制、發(fā)病進程及小鼠死亡時間均顯著推遲。與高劑量感染快速致死模型相比，這種低劑量感染的病毒復(fù)制與發(fā)病進程顯然更加接近人的自然感染與發(fā)病狀態(tài)，為研究探討H5N1高致病性AIV感染人類的發(fā)病機制提供了較為理想的研究模型。

本研究結(jié)果同時提示，即使低劑量病毒感染后，H5N1高致病性AIV仍有可能突破宿主天然免疫屏障，在多器官復(fù)制并產(chǎn)生致死性后果。這也部分解釋了為什么許多人的H5N1禽流感感染病例只有活禽市場暴露經(jīng)歷而無直接病原接觸史，但仍然引起嚴重的臨床癥狀和病理損傷，最終導(dǎo)致死亡，從而進一步揭示了H5N1亞型AIV對哺乳動物的高致病力，以及其對公共衛(wèi)生所具有的潛在危險性。

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