高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鑒定

張善瑞，周艷君，朱建平，童 武，姜一峰，童光志

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/豬傳染病研究室，上海200241)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬。PRRSV分為以LV株(Lelystad virus)為代表歐洲型和以VR-2332株為代表的北美型[1-4]。PRRSV基因組長(zhǎng)約15 kb，在5'端有帽子結(jié)構(gòu)，3'端有poly(A)尾，共包含9個(gè)閱讀框(ORF)，其中ORF1a和1b位于病毒基因組5'端非編碼區(qū)(UTR)之后，編碼RNA復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，而ORF2～7分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N[5-6]。PRRSV可感染引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，一種以懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙和仔豬與育肥豬的呼吸道癥狀為特征的傳染病[7]。20世紀(jì)80年代末北美和歐洲相繼爆發(fā)PRRS，該病對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危害[8]。

2006年在我國(guó)南方一些省份的豬場(chǎng)爆發(fā)了一種豬“高熱”綜合癥，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為體溫高、發(fā)病率高和死亡率高等的臨床特點(diǎn)，隨后經(jīng)研究證實(shí)該病的主要病原為發(fā)生缺失變異的PRRSV[9-12]。目前，人們對(duì)PRRSV的致病機(jī)理、病毒毒力變異的機(jī)制以及持續(xù)性感染發(fā)生的機(jī)理等諸多問(wèn)題尚不十分清楚，反向遺傳操作系統(tǒng)的建立將有助于從分子水平上闡明這些問(wèn)題[13]。1998年Meulenberg等建立了第一個(gè)PRRSV反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺(tái)，其它不同PRRSV株的感染性克隆也相繼由不同的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建成功[14-16]。這些PRRSV的反向遺傳學(xué)平臺(tái)大都屬于歐美經(jīng)典PRRSV株，而關(guān)于高致病性PRRSV株的感染性克隆相關(guān)研究報(bào)道較少[17]。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建高致病性PRRSV HuN4株的感染性克隆，建立PRRSV強(qiáng)毒株反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究該病毒的生物學(xué)特性以及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、載體及試劑 PRRSV HuN4株由本實(shí)驗(yàn)室保存[12]；抗PRRSV核衣殼(N)蛋白單克隆抗體(MAb)由本實(shí)驗(yàn)室制備[18-19]，pBulescriptⅡSK(+)購(gòu)自Fermentas公司；RNeasy Plus Mini Kit試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物科技有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光抗體、SupersciptⅢreverse transcriptase和Platinum?pfxDNA polymerase購(gòu)自Invitrogen公司；RNase H、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit購(gòu)自Ambion公司；DL15000、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PRRSV HuN4株(EF635006)全基因組序列，用Olio6.0軟件設(shè)計(jì)了6對(duì)涵蓋全基因組序列的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中引物F16(sp6)引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)和RNA聚合酶sp6啟動(dòng)子核心序列，下游引物R15313中引入了NotⅠ酶切位點(diǎn)；利用引物R14670和F14668將14 680位的A突變成G產(chǎn)生一個(gè)MluⅠ酶切位點(diǎn)作為鑒定拯救病毒的分子標(biāo)記(表1)。

表1 PRRSV HuN4株全基因組cDNA片段擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for amplification of the genomic cDNA of PRRSV HuN4 strain

1.3 PRRSV HuN4株基因組片段的擴(kuò)增 將PRRSV HuN4株病毒接種于Marc145細(xì)胞，48 h后待細(xì)胞病變(CPE)致80%的細(xì)胞脫落時(shí)，收獲病毒培養(yǎng)液。反復(fù)凍融3次后，按照RNA提取試劑盒RNeasy Plus Mini Kit的操作說(shuō)明提取總RNA。

參照SupersciptⅢreverse transcriptase產(chǎn)品說(shuō)明書，以每個(gè)片段下游引物(表1)為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增參照Platinum?pfx DNA polymerase產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。PCR體積為50 μL，按常規(guī)PCR條件擴(kuò)增，退火溫度和延伸時(shí)間以每對(duì)引物的Tm值及其擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度作出相應(yīng)調(diào)整。

1.4 PRRSV HuN4株全長(zhǎng)cDNA的連接

1.4.1 pBluescriptⅡSK(+)載體改造 將pBluescriptⅡSK(+)的多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)進(jìn)行改造，按照?qǐng)D1所標(biāo)示的酶切位點(diǎn)的順序合成一段序列，替換pBluescriptⅡSK(+)中MCSXhoⅠ至NotⅠ的序列。

1.4.2 全長(zhǎng)cDNA連接 將擴(kuò)增得到的A～F各個(gè)PCR產(chǎn)物膠回收純化，按圖1所示的酶切位點(diǎn)分別對(duì)各片段進(jìn)行酶切，并分別克隆于經(jīng)過(guò)改造的pBluescriptⅡSK(+)中，然后通過(guò)圖1所示的酶切位點(diǎn)將A～F各片段相互拼接，對(duì)獲得的含有HuN4株全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定正確的克隆命名為pHuN4。

1.5 病毒RNA的體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)染 利用3'末段Poly(A)尾引入的NotⅠ酶切位點(diǎn)將包含全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒pHuN4線性化，根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成病毒RNA；根據(jù)DMRI-C轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將轉(zhuǎn)錄合成的RNA轉(zhuǎn)染于70%～90%單層的BHK-21細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，取細(xì)胞液上清并接種于Macr145細(xì)胞，觀察CPE，并進(jìn)行連續(xù)傳代。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 RT-PCR及酶切檢測(cè)分子標(biāo)記 分別提取拯救病毒的第5代病毒vHuN4和親本毒HuN4株感染細(xì)胞的RNA，利用包含分子標(biāo)記的引物JD1/JD2對(duì)其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別利用MluⅠ進(jìn)行酶切鑒定。所用鑒定引物序列為JD1：5'-CACAGCTCCACAGAAGGTGC-3'；JD2：5'-TAAC AGCTTTTCTGCCACCC-3'。

1.6.2 拯救病毒的間接免疫熒光(IFA)鑒定 將拯救病毒的第5代vHuN-4和親本病毒HuN-4分別接種Macr145細(xì)胞，在感染后48 h棄去培養(yǎng)液。采用預(yù)冷甲醇固定10 min，l%BSA室溫封閉30 min，以適當(dāng)稀釋的抗PRRSV N蛋白的MAb為一抗，以FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體為二抗，檢測(cè)拯救病毒。

1.7 拯救病毒生物特性學(xué)分析

1.7.1 拯救病毒TCID50的測(cè)定 預(yù)先將Macr145細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)成單層，將獲得的第5代拯救病毒進(jìn)行10倍系列稀釋，分別接種于Marc145細(xì)胞中。每稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)未接毒對(duì)照，于37℃5%CO2條件中培養(yǎng)，逐日觀察和記錄CPE，根據(jù)結(jié)果按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.7.2 拯救病毒生長(zhǎng)曲線的比較 以低劑量(0.1MOI)的病毒(親本毒HuN4株和拯救毒 vHuN4株)感染Macr145細(xì)胞，分別在感染后不同的時(shí)間段(12 h～96 h)收取細(xì)胞上清液，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

1.8 拯救病毒的致病性試驗(yàn) 選取15頭PRRSV、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)陰性30日齡左右的健康仔豬，隨機(jī)分為3組，其中A組為拯救病毒vHuN4接種組，B組為親本毒HuN4株接種組，C組為陰性對(duì)照組。親本毒和拯救病毒接種組的接種劑量均為3×104TCID50，其中肌肉2 mL，滴鼻1 mL。接種后分別逐日對(duì)其進(jìn)行體溫測(cè)定和臨床癥狀觀察，同時(shí)在接種發(fā)病期內(nèi)采集發(fā)病豬的血液樣品，檢測(cè)感染病毒的特征性標(biāo)記。

2 結(jié) 果

2.1 PRRSV HuN4株全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建 利用設(shè)計(jì)的6對(duì)特異性引物(表1)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得了PRRSV HuN4株全基因組的6個(gè)基因片段(圖2)。將獲得的6個(gè)片段分別連接到經(jīng)過(guò)改造的pBluescriptⅡSK(+)載體中，通過(guò)各片段逐一拼接構(gòu)建成含全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒pHuN4。經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證所構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA序列完全符合預(yù)期設(shè)計(jì)，即5'端引入了SP6啟動(dòng)子序列，3'端含有32 nt的poly(A)序列并引入了NotⅠ酶切位點(diǎn)。同時(shí)，在基因組第14 680位的A沉默突變?yōu)镚產(chǎn)生一個(gè)MluⅠ酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以作為鑒定拯救病毒的分子標(biāo)記。

2.2 拯救病毒的細(xì)胞病變觀察 將含HuN4全長(zhǎng)cDNA的pHuN4采用NotⅠ酶切線性化，體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA，將體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后的上清液接種Marc145細(xì)胞，連續(xù)傳至第5代，結(jié)果第5代病毒在接種后72 h可以觀察到典型的CPE(圖3)，并且其CPE的特征與親本強(qiáng)毒株HuN4株的基本一致。

2.3 拯救病毒的分子標(biāo)記檢測(cè) 對(duì)提取拯救的vHuN4和親本毒HuN4株感染細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MluⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示拯救病毒的PCR產(chǎn)物能被MluⅠ酶切為兩個(gè)片段，而親本病毒的則不能被切開(圖4)。

2.4 拯救病毒的IFA鑒定 將拯救的病毒vHuN4和親本病毒HuN4株分別接種Macr145細(xì)胞，48 h后分別用抗PRRSV N蛋白的MAb進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果拯救病毒與親本病毒感染的細(xì)胞均出現(xiàn)了特異性熒光(圖5)，表明所獲得的拯救病毒能被抗PRRSV的特異性抗體所識(shí)別。

2.5 拯救病毒的生物學(xué)特性 對(duì)拯救的第5代vHuN4株進(jìn)行TCID50測(cè)定，其病毒滴度為104.6TCID50/0.1 mL，以病毒生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)、以病毒在不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50為縱坐標(biāo)，繪制和比較親本病毒和拯救病毒的生長(zhǎng)曲線(圖6)。結(jié)果表明拯救病毒與親本病毒的生長(zhǎng)特性基本一致。

2.6 拯救病毒致病性試驗(yàn)結(jié)果 將HuN4株與vHuN4分別以同樣劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接種后第1 d HuN4組和vHuN4組均開始出現(xiàn)體溫升高，兩個(gè)接種組的豬體溫基本維持在40.5℃～42℃之間，持續(xù)約10 d，而未接種對(duì)照組的體溫正常，沒(méi)有出現(xiàn)體溫升高的現(xiàn)象(圖7)。同時(shí)接種病毒組的豬出現(xiàn)被毛粗糙、厭食、消瘦、喘息急促、腹部和肢體末端皮膚發(fā)紺、精神萎靡等臨床表現(xiàn)，在接種后第3 d接種組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，到第19 d兩個(gè)接種組的豬全部死亡，而整個(gè)試驗(yàn)期間未接種對(duì)照組始終保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)(圖8)。

2.7 親本病毒與拯救病毒感染豬的鑒別診斷 分別采集HuN4株與vHuN4接種組豬死亡前的血液樣本及對(duì)照組的血液樣品，提取RNA進(jìn)行病毒基因的RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，從A組拯救病毒接種組和B組親本病毒接種組的血液樣品中均能擴(kuò)增出約700 bp的特異性目的片段(圖9a)，而未接種對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)到目的片段，將A組和B組所擴(kuò)增出的目的片段分別用MluⅠ進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示：A組拯救病毒接種組的5份樣品均能被MluⅠ酶切成大小約為400 bp和200 bp的目的條帶，而B組親本病毒接種組的5份樣品則不能被MluⅠ所酶切(圖9b)，表明A組5頭豬感染的病毒為攜帶特異性標(biāo)記的拯救病毒。

3 討 論

本研究中采用了與Nielsen等類似的策略[15]，將PRRSV HuN4全基因組先分為6段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將各個(gè)片段單獨(dú)連入改造的載體pBluescriptⅡSK(+)，再將各個(gè)片段逐一連接起來(lái)，構(gòu)建成病毒全長(zhǎng)cDNA，試驗(yàn)流程比較簡(jiǎn)潔并且獲得的序列具有很高的保真性，測(cè)序結(jié)果完全正確。

由于PRRSV基因組較長(zhǎng)，較難獲得真實(shí)的cDNA序列，隨著RNA序列的延長(zhǎng)，RT-PCR的保真性也成比例下降。本實(shí)驗(yàn)中使用耐熱SupersciptⅢreverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶能大大增加逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長(zhǎng)度，其耐熱特性使得反應(yīng)甚至可以在高達(dá)55℃的溫度下進(jìn)行，最大程度上減小RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)反轉(zhuǎn)錄的阻礙，使用的聚合酶Platinum?pfxDNA polymerase具有強(qiáng)的校讀活性，高保真反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的應(yīng)用降低了RT-PCR過(guò)程中可能出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，使得合成全長(zhǎng)cDNA拷貝時(shí)突變因素降低。常用的啟動(dòng)子主要有大腸桿菌λ噬菌體Pm(Pr改造產(chǎn)物)，SP6、T3和T7啟動(dòng)子[20]。由于本實(shí)驗(yàn)所用載體中含有T7啟動(dòng)子，很難將病毒序列直接置于啟動(dòng)子之后，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)，將5'端上游引物中引入SP6啟動(dòng)子序列。這樣擴(kuò)增出來(lái)的序列可以直接作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，保證了基因序列的忠實(shí)性和基因組末端序列的精確性。有報(bào)道表明在基因組5'末端增加2個(gè)G可以提高體外轉(zhuǎn)錄效率[16]，因此設(shè)計(jì)引物時(shí)我們?cè)赟P6核心啟動(dòng)子與5'末端序列之間也增加了2個(gè)G，并通過(guò)PCR過(guò)程引入了全長(zhǎng)病毒cDNA中。

本研究中我們利用SP6體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得了具有感染性的病毒RNA，成功的在Macr145細(xì)胞中救獲了病毒，并通過(guò)對(duì)引入的分子標(biāo)記和IFA檢測(cè)等證實(shí)獲得了具有感染性的PRRSV HuN4株的拯救病毒vHuN4株，對(duì)vHuN4的生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果表明，所獲得的vHuN4在Macr145細(xì)胞上引起的CPE呈聚集狀，該拯救病毒的生長(zhǎng)特性基本與親本病毒HuN4株相一致。而且對(duì)vHuN4進(jìn)行致病性試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)獲得的拯救病毒能夠使感染豬100%發(fā)病，并且可以導(dǎo)致發(fā)病豬死亡，對(duì)實(shí)驗(yàn)豬呈現(xiàn)的致病特征與親本病毒HuN4株的致病特征相似[9-12]。為了排除試驗(yàn)感染豬中是否存在親本病毒或與親本病毒相類似的野毒的干擾，我們通過(guò)對(duì)人工引入拯救病毒中的MluⅠ限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切分析，進(jìn)一步證實(shí)試驗(yàn)組感染的病毒不存在親本病毒或與親本病毒相似的自然感染野毒。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明我們成功建立了高致病性PRRSV親本病毒HuN4株的反向遺傳操作平臺(tái)，獲得了高致病性PRRSV親本病毒HuN4株的感染性拯救病毒vHuN4，該拯救病毒保持了與親本病毒相一致的生物學(xué)特性，為我們今后深入研究高致病性PRRSV的病原學(xué)和致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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