左金丸不同提取液HPLC指紋圖譜比較Δ

黃艷萍，劉德玲，劉浩，譚曉梅（.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州市5050；.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州市 5055）

左金丸出自《丹溪心法》，由黃連與吳茱萸按6∶1比例制成，具泄火、疏肝、和胃、止痛功能，用于治療肝火犯胃、脘脅疼痛、口苦嘈雜、嘔吐酸水、不喜熱飲。其主要有效部位為總堿（黃連生物堿和吳茱萸生物堿）[1，2]。對(duì)左金丸有效成分的提取方法有水提、醇提和半仿生提取法，但提取結(jié)果均以浸膏得率、生物堿的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)[3，4]。筆者應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)左金丸不同提取液的指紋圖譜進(jìn)行研究，結(jié)合保留時(shí)間、各共有峰的相對(duì)峰面積考察左金丸不同提取液的指紋圖譜的相關(guān)性，比較不同提取工藝對(duì)左金丸提取液指紋圖譜的影響，填補(bǔ)文獻(xiàn)報(bào)道之不足，并為左金丸化學(xué)成分和制劑工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1100型HPLC儀，配DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（18 MΩ，美國(guó)Millipore公司）；AS5150BD-1型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；PB-10型精密pH計(jì)、BP221D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

黃連、吳茱萸藥材購(gòu)于廣州致信藥材有限公司，經(jīng)廣東省中藥研究所蔡岳文主任中藥師鑒定黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensiFranch.的干燥根，吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實(shí)；鹽酸小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110713-200510、110802-200504、110801-200505、0733-200004、110732-200506）；表小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥新藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞98.8%）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 水提液的制備 按處方比例精密稱(chēng)取黃連6 g、吳茱萸1 g，加藥材10倍量的水回流提取3次（加提取溶劑的量依次為藥材體積的10、8、8倍），提取時(shí)間依次為2、1、1 h，合并煎煮液，藥渣用少許提取溶劑沖洗，濾過(guò)，取濾液作為樣品溶液。

2.1.2 醇提液的制備 按處方比例精密稱(chēng)取黃連6 g、吳茱萸1 g，加藥材10倍量的60%乙醇回流，其他操作同“2.1.2”項(xiàng)下，制得樣品溶液。

2.1.3 半仿生提取液的制備 按處方比例精密稱(chēng)取黃連6 g、吳茱萸1 g，加藥材10倍量的水回流提取3次（提取時(shí)間依次為170、85、40 min），第一次提取時(shí)以0.1 mol·mL-1HCl調(diào)pH值至2.0，第2、3次提取時(shí)以0.1 mol·mL-1NaOH分別調(diào)pH值至 6.5、9.0，將各提取液過(guò)濾，合并上清液，制得樣品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 分別取上述提取液各適量，3 000 r·min-1離心20 min，合并上清液，濃縮并用提取溶劑定容至100 mL，即得樣品液（0.07 g·mL-1）；精密吸取樣品液5.0 mL，置于10 mL量瓶中，用提取溶劑定容，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.1.5 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取適量吳茱萸堿、吳茱萸次堿、鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品（標(biāo)準(zhǔn)品），加甲醇配制成濃度分別為0.812、0.724、1.027、1.139、1.114、1.216 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-25 mmo·L-1磷酸二氫鉀溶液（B，pH 4.5），梯度洗脫（0～35 min，10%～45%A；35～65 min，45%～60%A）；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描，重點(diǎn)考察210、225、254、343、350、356 nm波長(zhǎng)處的出峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在225 nm波長(zhǎng)處出峰少，而在254 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰少、特征峰信息明顯，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 柱溫的選擇 在同一條件下考察20、25、30、35、40℃柱溫對(duì)色譜峰分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25℃時(shí)的分離效果最佳，故選擇柱溫為25℃。

2.2.3 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，同一條件下甲醇較乙腈對(duì)左金丸提取物的分離效果更佳，在色譜條件優(yōu)化后期，為提高分離效果，將水相由水改為25 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液，并調(diào)pH值為4.5，可得到較滿(mǎn)意的效果。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一半仿生提取供試品溶液適量，照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.15%～1.70%和0.60%～1.50%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一半仿生提取供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、48 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為1.36%～1.30%和1.10%～2.04%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方比例取黃連、吳茱萸藥材，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份半仿生提取供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.46%～2.33%和1.42%～2.91%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 不同提取液指紋圖譜的建立

在上述色譜條件下，對(duì)各提取液進(jìn)樣分析。不同提取液在相同色譜條件下的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 左金丸不同提取液的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of different extracts of Zuojin pills

2.4.1 共有特征指紋峰的標(biāo)定 選擇11個(gè)分離度好、峰面積較大的峰作為特征峰，詳見(jiàn)圖2。

圖2 左金丸半仿生提取液的HPLCFig 2 HPLC fingerprint of Zuojin pills by semi-bionic extraction

由圖2可見(jiàn)，其中9號(hào)峰峰面積百分比較大，且位于色譜圖較中間的位置，分離度較好，故以其作為內(nèi)參照峰。通過(guò)色譜保留時(shí)間和紫外吸收光譜鑒定左金丸指紋圖譜中主要色譜峰，其中3、4號(hào)峰分別為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，5、6、7、9號(hào)峰依次為鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿。

2.4.2 特征峰峰面積的比較 不同提取液HPLC指紋圖譜11個(gè)特征峰的峰面積見(jiàn)表1。為便于比較，將不同方法提取液特征峰峰面積均除以半仿生提取液的特征峰峰面積，并求平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

從整體角度判斷，左金丸3種不同提取液指紋圖譜中，以半仿生提取液主要出峰為基準(zhǔn)（見(jiàn)圖2中1～11號(hào)峰），與醇提液、水提液指紋圖譜比較，可得醇提液與半仿生提取液的主要特征峰相同、峰面積接近、保留時(shí)間基本相同；水提液指紋圖譜中少了1、4、11號(hào)峰。

通過(guò)將醇提液和水提液中主要共有峰的峰面積以半仿生提取液圖譜為基準(zhǔn)作比較，發(fā)現(xiàn)醇提液指紋圖譜主要色譜峰的峰面積除1、4、13號(hào)峰大于半仿生提取液，5號(hào)峰小于半仿生提取液以外，其余峰的峰面積與半仿生提取液基本相等；水提液指紋圖譜中共有色譜峰的峰面積均小于半仿生提取液。

表1 3種提取液指紋圖譜的特征峰峰面積Tab 1 Characteristic peak area of the fingerprint of 3 kinds of extracts

表2 其他提取液特征峰峰面積與半仿生提取液特征峰峰面積的比值Tab 2 Ratio of characteristic peaks area of other extract to the characteristic peaks area of semi-bionic extract

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道左金丸不同提取液的抑菌效果有所差別[5]，而左金丸古方以水丸入藥，如何從整體上評(píng)價(jià)不同提取工藝提取物指紋圖譜的差異性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)建立了左金丸不同提取液最優(yōu)的HPLC指紋圖譜條件，所建立的指紋圖譜中左金丸主要有效成分為黃連生物堿和吳茱萸生物堿得到了確認(rèn)。在完全相同的色譜條件下，左金丸水提取液、60%乙醇提取液與半仿生提取液指紋圖譜中各色譜峰均能得到很好的分離，使工藝具有可比性。

通過(guò)左金丸不同提取液HPLC指紋圖譜的比較研究，可得左金丸60%乙醇提取液與半仿生提取物的指紋圖譜比較相似，而其與水提液指紋圖譜差異較大，前兩者之間有11個(gè)共有峰；三者之間則有8個(gè)共有峰，分別為2、3、5～10號(hào)峰。

[1] 陳蔚文，藍(lán)韶清，李茹柳，等.左金丸抗?jié)兗耙种莆敢悍置诘膶?shí)驗(yàn)研究[J].廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，8（3）：224.

[2] 陸永才.左金丸治療幽門(mén)螺桿菌感染133例臨床觀(guān)察[J].浙江中醫(yī)雜志，1997，32（10）：437.

[3] 賴(lài)慶寬，廖 芳，李世娟，等.左金丸提取工藝的優(yōu)化研究[J].中成藥，2008，30（10）：1 560.

[4] 張 穎，張兆旺.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選左金丸方藥的半仿生提取工藝[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（4）：466.

[5] 張 穎，張兆旺.左金丸方藥3種方法提取液的初步藥效學(xué)比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（10）：2 458.