不同溫度下雌激素對施氏鱘早期性腺發(fā)育及血清性激素的影響

張 穎，孫大江，曲秋芝，劉海金

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；3.中國水產科學研究院，北京 100141）

施氏鱘（Acipenser schrenckii）為鱘科魚類，俗名七粒浮子，分布于中俄界河的黑龍江及其附屬水系。近年來，由于環(huán)境惡化及過渡捕撈使野生施氏鱘的資源急劇下降，目前為我國Ⅱ級保護種類[1]。鱘魚籽醬具有“黑色黃金”之稱，國際市場上高達500～700 美元·kg－1[3]。因此，在鱘魚商品魚養(yǎng)殖利潤空間穩(wěn)定的情況下，鱘魚的全雌化生產將提高鱘魚養(yǎng)殖的利潤空間，促進鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

自Yamamoto等1969年提出了性激素在誘導魚類性別轉換方面的作用后，該方法已成功在50多種海、淡水魚類的全雌化生產中應用[4－6]。外源雌激素誘導法因其操作簡單，在幼魚時期即可操作，省時省力，成為鱘魚全雌化生產的研究熱點。但由于諸多因素的限制，目前也僅在短吻鱘、意大利鱘和雜交鱘中有成功的報道，如Grandi等采用17β－E2400 μg·L－1浸泡意大利鱘受精卵后，促使意大利鱘的性分化提前[7－10]。Shawn等的研究表明濃度分別為10、50 和 100 mg·kg－1的 17β－E2對 5 月齡的短吻鱘（Acipenser brevirostrum）持續(xù)投喂9個月后的雌性化誘導率分別是65%和58%[8]。Nataka等對已發(fā)生性分化的3月齡的雜交鱘（Huso huso♀×Acipenser ruthenus♂）投 喂 1 μg·g－117β －E2和 17α －methyltestosterone（MT）450 d后可發(fā)生雌性化和雄性化[11]。目前尚末在施氏鱘中有相關報道。此外，魚類的性別是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用共同決定的。在諸多的環(huán)境因素中，研究較多的是溫度對性腺分化的影響。不同的溫度可誘導不同種魚類的性腺向雄性或雌性分化。如在高溫（36℃）下，奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）雄性率可達98%。在（32±1）℃的條件下[12]，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的雄性率可達90%[13]。而在一些魚類則相反，如南美洲的另一種銀漢魚（Odontesthes bonariensis）在低溫（17℃）下，雌性率達100%，在高溫（29℃）下則為0%[14]，而溫度對鱘魚性分化作用方面還未見研究報道。因此，本試驗采用溫度和外源雌激素注射的誘導方法，期望在施氏鱘性腺發(fā)育早期了解其性腺分化、性別比率和血清性激素水平，了解溫度和外源雌激素在施氏鱘發(fā)育早期對其性分化的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

試驗用魚采自中國水產科學研究院鱘魚繁育工程中心在2010年4月下旬自繁純種施氏鱘。人工飼料開口馴化結束后，即孵化后70 d運輸?shù)街袊a科學研究院黑龍江水產研究所，暫養(yǎng)到90 d后，開始試驗，實驗魚平均體長（10.2±5.88）cm，平均體重（15.19±2.95）g。

1.2 試驗設計

試驗采用循環(huán)水系統(tǒng)，水族箱為95 cm×50 cm×60 cm，試驗魚經充分暴氣3 d后的水馴養(yǎng)1周后，供試驗用，pH保持在7.5左右，溶解氧濃度＞6.0 mg·L－1，光照為自然光源。同批魚卵孵化至90 d，按平均體長、體重一致的原則，將實驗魚隨機分為5個溫度處理（15，18，21，24和27℃）組，每個溫度處理組2個重復，每個重復30尾魚。采用電子溫控器控制溫度（±0.5℃）。將雌激素溶解于30%、45%、60%和75%的醫(yī)用乙醇中，配置為2 mg·mL－1的濃度，計算死亡率后選取最適乙醇濃度注射，注射濃度為0.1 ug·g－1。各試驗組在所設定的溫度中培育30 d至孵化后120 d。各試驗組和對照組于注射第1天、7天、15天和30天采集血漿液氮保存。對照組為相同溫度下的未注射組。養(yǎng)殖方法幼魚期投喂人工飼料，每日投喂3次，日投喂率為4%。

1.3 血漿性激素的測定方法

用注射器浸潤肝素鈉后，于尾椎動（靜）脈取血。血樣先注入置于碎冰中的1.5 mL塑料離心管內，室溫放置 1 h 后，5 000 r·min－1離心 10 min，血漿入液氮中速凍后再置－20℃冰箱中保存，待測l7β－雌二醇（17β－estradiol，E2）和睪酮（Testosterone，T）含量。采用BECMAN ACESSⅡ電化學法光儀測定血漿中E2和T濃度，E2和T電化學發(fā)光試劑盒由BECMAN提供。

1.4 組織學切片制作

飼養(yǎng)試驗30 d結束后，于120 d分別計算其成活率。采其性腺組織，Bouin′s液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色。在OLYMPUS BX51顯微鏡（配冷光源數(shù)碼相機OLYMPUS DP70）下觀察，拍照。早期性腺發(fā)育分期參照Flynn的方法[9]。通過對各組所有存活個體的性腺切片進行觀察，確定性別，計算其雌雄比率。

1.5 數(shù)據處理

試驗數(shù)據經處理后采用SPSS11.0軟件對成活率和雄性率進行t檢驗(t－test)。

2 結果與分析

2.1 溫度和注射17β-E2對施氏鱘死亡率的影響

不同溫度處理組的死亡率統(tǒng)計結果見表1。對照組（未注射）中，28℃處理組的死亡率顯著高于其他溫度組，而其他溫度試驗組間的死亡率差異不顯著，均低于1%。經激素處理后，28℃組的死亡率最高，其他組的死亡率沒有顯著的規(guī)律。由此可見，除高溫組外，其他溫度對試驗魚的死亡率沒有影響。

2.2 不同養(yǎng)殖溫度下注射17β-E2對施氏鱘血漿T濃度的影響

如表2所示，注射17β－E224 h后，各溫度組血漿T含量下降到0 ng·mL－1，顯著低于對照組（P＜0.05）。注射后1～15 d各組血漿T含量均為0 ng·mL－1，一直持續(xù)到注射后 30 d，21、25 和 28℃高溫組血漿T含量開始緩慢回升到0.33～0.41 ng·mL－1，說明注射 17β－E2顯著降低了血漿 T 含量?？偟淖兓厔菔牵禾幚砗?4 h后達到最低值，即各溫度組血漿T含量明顯下降到0。30 d時以高溫組開始回升，21、24和27℃組血漿T水平與對照組差異不顯著（P＞0.05）。注射 17β－E2后，溫度同時也對施氏鱘的血漿T水平具有一定調控作用。

表1 不同溫度下注射17β-E2的死亡率Table 1 Mortality of 17β-E2injection by different temperature

表2 17β-E2注射后不同溫度下施氏鱘血清T水平的變化Table 2 Changes of serum T levels of Amur sturgeon under different temperature by 17β-E2injection

2.3 不同養(yǎng)殖溫度下注射外源雌激素對施氏鱘血漿E2濃度的影響

如表3所示，17β－E2注射后24 h血漿E2水平顯著升高，明顯高于對照組（P＜0.05）。注射7～15 d，血漿溫度E2水平顯著下降，以15℃組下降最慢顯著高于對照組（P＜0.05），28℃組與對照組無顯著差異（P＞0.05），而18℃組、21℃組和24℃組顯著低于對照組（P＜0.05）。注射30 d時E2水平略有回升，其中18℃組、21℃組和24℃組與對照組無顯著差異（P＞0.05），15℃組和27℃組顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可以看出，注射17β－E2后，在短時間內顯著提高了施氏鱘血漿E2水平后，隨之血漿E2水平后很快降低，不久后又開始持續(xù)回升?？偟淖兓厔菔牵鹤⑸?7β－E224 h后，各溫度組血漿E2水平明顯升高，7 d后開始緩慢降低，15 d后降到最低值后，開始回升，30 d時有所回升，以21和24℃組回升最快。注射17β－E2后，溫度也對施氏鱘血漿E2水平具有一定調控作用。

表3 17β-E2注射后不同溫度下施氏鱘血清E2水平的變化Table 3 Changes of serum E2levels of Amur sturgeon under different temperature by 17β-E2injection

2.4 不同養(yǎng)殖溫度下注射外源雌激素對施氏鱘性腺分化及性別比率的影響

與對照組比，17β－E2注射的各溫度處理組的性腺外部形態(tài)結構相同，其發(fā)育特點是早期性腺均為線條狀，白色，成對存在，外被一層薄的結締組織（見圖版Ⅰ－a）。

本試驗結束時對照組的性腺已完成PGC細胞向性腺原基的遷移，體細胞、性原細胞和生殖上皮細胞數(shù)量迅速增加，體組織增生物向性腺腹腔凸出，形成原始性腺雛形，性腺內血管增多（見圖版I－b）。低溫沒有抑制了施氏鱘性腺的早期發(fā)育（見圖版Ⅰ－c，d），而高溫更促進了施氏鱘性腺的早期發(fā)育（見圖版Ⅰ－m，n）。激素處理組中的高溫組的性腺出現(xiàn)2種不同的表面結構，性腺開始分化。其中，生殖上皮光滑，不具有皺褶或生殖溝的性腺原基發(fā)育為精巢（見圖版Ⅰ－c，h，k，n），而生殖上皮有內陷、褶皺和深溝的性腺原基發(fā)育為卵巢（見圖版Ⅰ－d，f，g，m）。注射 17β－E2和溫度能使施氏鱘的性分化時間提前，但不能改變群體中的雌雄1∶1的性別比率（見表4）。

表4 溫度和外源雌激素對施氏鱘性別比率的影響Table 4 Effects of temperature and 17β-E2on sex ratios of Amur sturgeon

圖版Ⅰ 溫度和外源雌激素對施氏鱘性分化和性別比率的影響PlateⅠ Effect of temperature and estradiol-17β on sex differentiation and sex ratio of Amur sturgeon

3 討論

3.1 激素處理對死亡率的影響

研究表明，激素誘導魚類性轉化時，處理強度對成活率有影響。Flynn等研究表明estradiol-17β對短吻鱘幼魚具有一定的致死作用[9]。張曉彥、Knorr和阮洪超等的研究結果表明，性激素的劑量與試驗魚死亡率關系密切[15-17]。在本試驗中，雌二醇濃度的濃度為0.1 μg·L-1注射處理，隨養(yǎng)殖水溫的不同出現(xiàn)了較高的死亡率。由此可見，本試驗所使用的激素劑量對施氏鱘成活率基本沒有影響。

3.2 溫度和外源雌激素對施氏鱘血漿性激素的影響

在性激素產生過程中，有一系列的酶促反應參與，高溫或低溫有可能通過芳香化酶的催化作用，最終影響魚體內雌、雄激素的產生[18-20]。本試驗中，在受到外源激素的影響后，21℃組的雌激素含量恢復較快，這可能與溫度影響體內性激素（雄激素和雌激素）的產生的結論相一致。溫度影響芳香化酶的表達已有試驗證明，如對斑馬魚（Danio rerio）的研究表明，高溫誘導基因型雌性斑馬魚轉化為表型雄性的逆轉過程中，引起了卵母細胞凋亡和性腺中的芳香化酶活性降低[20-21]。此外，南方鯰（Silurus meridionalis）的人工繁殖后代全是雌性，但使用非類固醇類芳香化酶抑制劑（Fadrozole）處理孵化不久的幼魚可以得到高比例的雄魚，表明芳香化酶的活性可能受到了抑制，不能催化雄激素轉化成雌激素，從而使雌魚性逆轉為雄魚[22]。

注射17β-E2后，施氏鱘體內的內分泌平衡水平被破壞。其總的規(guī)律是不同溫度下，血漿E2的水平增加而T濃度顯著降低至0 pg·mL-1，這可能高水平的E2濃度與T濃度產生拮抗作用，抑制體內T濃度的產生[23]。此外，對真鯛（Pagrus major）的研究表明，在一天的不同時間內采樣測定血漿T和E2的含量，會有很大差別，血漿性類固醇激素的分泌存在日變化節(jié)律，且與光周期有密切關系[24]。本研究中施氏鱘為底層魚類，各組的采樣條件也均一致，因此不受采樣時間和光周期的限制。環(huán)境不適或操作脅迫均可能造成血漿T水平升高不顯著或者下降，特別是環(huán)境脅迫作用最有可能是血漿T水平下降的直接原因[24]。本試驗中，雖然注射雌二醇后，不同溫度條件下的T濃度顯著降低至0 pg·mL-1，但隨著體內E2的水平的變化，30 d后開始恢復，因此不認為是環(huán)境脅迫作用導致血漿T水平的顯著下降。

3.3 溫度和外源雌激素對施氏鱘性分化和性比的影響

解剖學上鱘開始出現(xiàn)雌雄分化的時間在不同種之間差異較大。Grandi等報道納氏鱘（A.naccarii）于6月齡性腺開始雌雄分化，俄羅斯鱘（A.gueldenstaedtii）在 3月齡、雜交鱘（Huso huso x A.ruthen）在6月齡、小體鱘（A.ruthen）在8月齡、短吻鱘（A.brevirostrum）在 7月齡、而中華鱘（A.sinensis）在 9月齡性腺開始雌雄分化[9，25-27]。本研究中，施氏鱘在孵化后120 d還沒開始性分化，表明施氏鱘的性腺分化時間要長于俄羅斯鱘。姚道霞等人和張曉彥等人對黃顙魚和半滑舌鰨的報道表明，用17β-E2處理黃顙魚和半滑舌鰨時，雌二醇促使其卵巢提前分化，而使精巢分化推遲[15，28]。其原因可能是在魚類性分化過程中起了關鍵作用的芳香化酶可以刺激卵巢的分化，而外源性雌激素可以顯著提高魚類芳香化酶的產生[15]。因此，在魚類性分化之前，進行外源性雌激素處理，會促使魚體內雌性激素的分泌量增加和雄性激素的降低，從而使魚類的卵巢分化提前，精巢分化滯后。本研究中17β-E2和溫度處理使施氏鱘性腺均已在組織學水平上出現(xiàn)性分化，其中27℃高溫組明顯的促進其性腺的提前發(fā)育，未觀察到精巢分化滯后的現(xiàn)象。此外，雌激素用于誘導產生雌魚，雄激素則根據劑量不同用于誘導雄性化或不育魚。而激素處理對性分化的影響除了正常的性轉化外，還可能使性腺出現(xiàn)畸形，如卵巢與精巢共存、精巢中出現(xiàn)卵巢腔或是性腺萎縮等[28]。本試驗中未發(fā)現(xiàn)雌雄間體、性腺萎縮等現(xiàn)象這與半滑舌鰨性分化的組織學的研究結果一致[15]。

研究表明，CYP19可以催化雄激素轉化為雌激素，被認為是性腺性別分化中的關鍵酶，控制著性激素的相對比率，比率的高低決定性別分化的方向[29]。溫度通過影響芳香化酶基因的表達或其調節(jié)基因的活性而最終影響性腺性別的分化[29-30]。在本試驗中溫度和外源雌激素是否是通過影響芳香化酶，從而影響雄激素／雌激素比率來影響施氏鱘性別分化的還需要進一步研究，但是可以肯定的是在本研究中，施氏鱘的雄激素／雌激素比率通過溫度和外源雌激素發(fā)生了顯著的改變。有研究認為，魚類性分化過程中芳香化酶起了關鍵作用，可以刺激卵巢的分化，而外源性雌激素可以顯著提高魚類芳香化酶的產生[31-33]。

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