雌激素受體及芳香化酶在牙齦癌組織中的表達(dá)和意義

王秋銳，楊 健，趙華平，張英懷

（1．北京市通州區(qū)新華醫(yī)院口腔科，北京101100；2．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科，河北石家莊050000）

雌激素受體及芳香化酶在牙齦癌組織中的表達(dá)和意義

王秋銳1，楊 健1，趙華平2，張英懷2

（1．北京市通州區(qū)新華醫(yī)院口腔科，北京101100；2．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科，河北石家莊050000）

目的：觀察牙齦癌中雌激素受體（ER）與芳香化酶的表達(dá)情況，探討局部雌激素及芳香化酶在牙齦癌中的作用與關(guān)系。方法：免疫組化過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素法測定雌激素受體及芳香化酶在牙齦癌中的表達(dá)。結(jié)果：牙齦癌組雌激素受體及芳香化酶的表達(dá)陽性率分別為50%和42．86%，正常對照組分別為13．33%和6．67%（P＜0．05）；牙齦癌中雌激素受體與芳香化酶之間未見明顯相關(guān)性。結(jié)論：牙齦癌有一定的雌激素依賴性；芳香化酶在牙齦癌組織中表達(dá)升高，但芳香化酶并不是影響局部雌激素受體升高的唯一因素。

牙齦；鱗狀細(xì)胞癌；雌激素受體；芳香酶；免疫組織化學(xué)

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：304］

自從Vittek等［1］第一次提供了牙齦可能是雌激素靶組織的直接依據(jù)后，許多研究證明牙齦是性激素受體的靶器官，性激素代謝紊亂與牙齦的許多疾病有關(guān)［2－4］。芳香化酶能催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素局部生物合成中的限速酶，它在許多組織（如卵巢、脂肪、腎上腺等）中均有表達(dá)。芳香化酶的過度表達(dá)，與異常的循環(huán)雌激素水平和（或）組織中局部升高的雌激素濃度有關(guān)。牙齦癌是常見的口腔癌之一，曾有研究認(rèn)為其具有一定程度的雌激素依賴性［5］，而牙齦癌與芳香化酶的相關(guān)研究尚未見報道。本文對牙齦癌組織中ER及芳香化酶的表達(dá)進(jìn)行研究，并對它們的相互關(guān)系進(jìn)行探討，以期為牙齦癌的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1．1 主要材料、試劑和儀器

小鼠抗人雌激素受體（ER，Zymed公司，美國）；多克隆兔抗人胎盤芳香化酶抗體（R－11－4，使用濃度為1∶800；由美國Houptman－woodward醫(yī)學(xué)研究所提供）；兔抗人芳香化酶抗血清aromatase、多抗原液、Hauptman－Woodward（美國醫(yī)學(xué)研究所）；石蠟切片機(jī)（Leica RM2135，德國）；QP－B2切片漂烘溫控儀（安徽省電子科學(xué)研究所）；HZS－H水浴震蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；ZD－Ⅲb醫(yī)學(xué)實驗用微波爐（上海中達(dá)醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究所）；PW／10－002臺式保溫培養(yǎng)箱（重慶實驗設(shè)備廠）；PM－10ADS雙目顯微鏡（Olympus，日本）。

1．2 樣本采集

牙齦癌組28例（男15人，女13人），年齡28～74歲（平均59．7歲）。牙齦癌標(biāo)本均來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1998～2011年手術(shù)切除的存檔石蠟標(biāo)本，切片后進(jìn)行HE染色，由病理學(xué)專家根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)重新閱片確診。對照組正常牙齦15例（男7人，女8人），年齡17～64歲（平均45．9歲）。來自頜骨囊腫開窗術(shù)切取的牙齦組織，經(jīng)HE染色后閱片確診。以上所有患者均無激素治療史。

1．3 方法

每個蠟塊均切片3張，每片5μm，1張陰性對照，另2張分別作ER及芳香化酶染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水漂洗5 min；50 mL／L H2O2甲醇振洗25 min，PBS振洗5 min×3次；用0．01 mol／L枸櫞酸鹽修復(fù)液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，92～98℃修復(fù)10 min，PBS振洗5 min×3次；正常山羊血清封閉，37℃孵育30 min；棄去血清，滴加一抗，4℃過夜；PBS振洗5 min×3次，滴加生物素化二抗，37℃孵育25 min，PBS振洗5 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃孵育20 min，PBS振洗5 min×3次；DAB顯色，漂洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。

1．4 結(jié)果判斷

ER以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，著色高于背景底色為陽性。染色分級標(biāo)準(zhǔn)：①無陽性細(xì)胞為陰性（－）；②陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為弱陽性（＋）；③陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%為中度陽性（＋＋）；④陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

芳香化酶陽性反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色細(xì)顆粒狀，位于細(xì)胞漿中。分級標(biāo)準(zhǔn)：①無陽性細(xì)胞為陰性（－）；②陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為弱陽性（＋）；③陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為陽性（＋＋）；④陽性細(xì)胞數(shù)＞25%為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

ER與芳香化酶用已知陽性的乳腺癌標(biāo)本作陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。

1．5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組間陽性率的比較用χ2檢驗，兩指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系用列聯(lián)表的χ2檢驗，出現(xiàn)小值頻數(shù)時用Fisher精確概率法。檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 ER在牙齦癌組和對照組中的表達(dá)

牙齦癌組、對照組ER的陽性率分別為50%、13．33%，兩組相比有顯著性差異（P＜0．05）。對照組中，15例正常牙齦組織中2例有ER表達(dá)，均為中度陽性，余皆為陰性（表1）。ER陽性部位位于牙齦上皮細(xì)胞的胞核（圖1），主要在棘層細(xì)胞表達(dá)，基底層細(xì)胞幾乎不表達(dá)。在28例牙齦癌中ER有14例為陽性，其中強(qiáng)陽性2例，中度陽性3例，弱陽性9例，余皆為陰性（表1）。其陽性部位主要在腫瘤上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)（圖2）。

表1 ER在牙齦癌組和對照組中的表達(dá)情況

2．2 芳香化酶在牙齦癌組和對照組中的表達(dá)

牙齦癌組和對照組芳香化酶的染色陽性率分別為42．86%、6．67%，兩組相比有顯著性差異（P＜0．05）。對照組中，15例正常牙齦組織中芳香化酶僅有1例表達(dá)，為弱陽性，余皆為陰性（表2）。芳香化酶陽性部位位于牙齦組織固有層中的少數(shù)炎癥細(xì)胞的胞漿（圖3）。在28例牙齦癌中芳香化酶有12例為陽性，其中強(qiáng)陽性3例，中度陽性5例，弱陽性4例，余皆為陰性（表2）。陽性部位主要在炎癥細(xì)胞（主要是漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)）的胞漿（圖4），在癌細(xì)胞與固有層的成纖維細(xì)胞也有表達(dá)（圖5～6）。

表2 芳香化酶在牙齦癌組和對照組中的表達(dá)情況

2．3 牙齦癌中ER表達(dá)與病理學(xué)分級及患者性別的關(guān)系（表3～4）

在分級不同（高、中、低分化）的牙齦鱗狀細(xì)胞癌中ER的表達(dá)情況未見明顯差異。在不同性別的牙齦癌病人中ER的表達(dá)情況未見明顯差異。

表3 ER在不同分化的牙齦鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

表4 ER在不同性別的牙齦癌病人中的表達(dá)情況

2．4 牙齦癌中ER與芳香化酶之間的關(guān)系

牙齦癌中ER與芳香化酶的表達(dá)未見明顯的相關(guān)性（P＞0．05）（表5）。

表5 牙齦癌中ER與芳香化酶之間的關(guān)系

圖1 正常牙齦組織中，ER陽性部位在牙齦上皮細(xì)胞的胞核（SP，×400）

圖2 牙齦癌組織中，ER陽性部位主要在腫瘤上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)（SP，×400）

圖3 正常牙齦中，芳香化酶陽性部位在牙齦組織固有層中的少數(shù)炎癥細(xì)胞的胞漿（SP，×400）

圖4 牙齦癌組織中，芳香化酶陽性部位主要在炎癥細(xì)胞的胞漿（a．SP，×200；b，SP×400）

圖5 牙齦癌組織中，芳香化酶在癌細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）

圖6 牙齦癌組織中，芳香化酶在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）

3 討論

若病變組織對雌激素有反應(yīng)，則病變細(xì)胞應(yīng)表達(dá)ER。28例牙齦癌中，14例中有ER表達(dá)，其陽性部位主要位于腫瘤上皮細(xì)胞胞核中，牙齦癌組與正常牙齦組 ER的陽性率有顯著性差異（P＜0．05）?？梢酝茰yER與牙齦癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，牙齦癌具有一定的雌激素依賴性。芳香化酶抑制劑能夠特異性地抑制芳香化酶的活性從而降低雌激素的水平，已成為治療多種雌激素依賴性疾病的新型藥物。國外有學(xué)者對16例未絕經(jīng)的子宮肌瘤患者進(jìn)行前瞻性的臨床研究表明，應(yīng)用芳香化酶抑制劑（來曲唑）后子宮肌瘤的體積明顯減?。?］。在乳腺癌的治療中，Balakrishnan等發(fā)現(xiàn)，對雌激素受體陽性的老年乳腺癌患者，與其他治療方法相比，芳香化酶抑制劑的先期治療可能最有效［7］。Niikaw等在對非小細(xì)胞肺癌患者研究后發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的雌激素濃度顯著高于來自同一患者的非腫瘤組織，且雌激素濃度與組織中芳香化酶的表達(dá)、ERα（雌激素受體α）和ERβ（雌激素受體β）的狀態(tài)、腫瘤的大小成正比，體外實驗還顯示在ERα和ERβ表達(dá)陽性的組織中應(yīng)用雌激素促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［8］。推測，采用芳香化酶抑制劑對ER陽性牙齦惡性腫瘤進(jìn)行內(nèi)分泌治療可望有效，但目前還缺乏大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和臨床實驗研究。

本研究表明芳香化酶在牙齦癌中的表達(dá)較正常牙齦組織明顯增加，芳香化酶主要在炎癥細(xì)胞（主要是漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)）表達(dá)，在癌細(xì)胞與固有層的成纖維細(xì)胞也偶有表達(dá)。提示芳香化酶與牙齦癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，它可能通過在炎細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中的旁分泌及癌細(xì)胞中的自分泌作用、刺激牙齦癌中局部微環(huán)境雌激素濃度升高，從而作用于牙齦癌的生長。但ER與芳香化酶之間未見明顯相關(guān)性（P＞0．05），表明在牙齦癌中芳香化酶可能并不是局部ER升高的唯一因素。這與對乳腺癌的研究結(jié)果一致［9－10］，在乳腺癌中其他的酶，如硫酸酯酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、17β－羥類固醇脫氫酶（17β－h(huán)ydroxysteroid dehydrohenase，17β－HSD）也影響雌激素的合成。Utsunomiya H等［11］在對子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜癌的研究發(fā)現(xiàn)，17β－HSD2能通過調(diào)節(jié)其組織中的雌二醇水平來調(diào)節(jié)雌激素的作用。他們認(rèn)為在子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜瘤中芳香化酶可能催化形成的雌激素多為雌酮，17β－HSD2可催化雌酮（一種較弱的雌激素）轉(zhuǎn)化為雌二醇，在子宮內(nèi)膜疾病的進(jìn)程中扮演重要角色。而牙齦癌是否與乳腺癌或子宮內(nèi)膜疾病類似，就需要研究芳香化酶和其他酶（硫酸酯酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、17β－HSD）的作用及其與雌激素的關(guān)系，從而探明牙齦癌中局部合成的雌激素的生物學(xué)意義。

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Estrogen receptor and aromatase expression in gingival carcinoma tissue

WANG Qiu－rui*，YANG Jian，ZHAO Hua－ping，ZHANG Ying－h(huán)uai
（*Beijing Tongzhou District Xinhua Hospital，Tongzhou 101100，China）

AIM：To investigate the expression of estrogen receptor（ER）and aromatase in gingival carcinoma．METHODS：ER and aromatase were detected by immunohistochemical staining SPmethod in gingival carcinoma（n＝28）and normal gingival tissues（n＝15）．RESULTS：Positive expression rates of ER and aromatase expression in gingival carcinoma were 50．00%and 42．86%，in normal gingival tissueswere 13．33%and 6．67%，respectively（P＜0．05）．No significant correlation was found between ER and aromatase in gingival carcinoma．CONCLUSION：Estrogen metablism might be related to gingival carcinoma．Aromatase is not the exclusive reason of the high positive rate of ER．

gingiva；squamous cell carcinoma；estrogen receptor（ER）；aromatase；immunohistochemistry

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0304－04

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．009

2015－01－08；

：2015－03－19

王秋銳（1977－），男，漢族，河北人。主治醫(yī)師