鵝源H5N1亞型禽流感病毒對SPF雛雞血液免疫功能的影響

鄭世民，王濱坤，高雪麗，劉超男，劉 明，呂曉萍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.上海恒豐強動物藥業(yè)有限公司，上海 201620；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001）

禽流感（Avian influenza，AI）是一種急性熱性接觸性傳染病[1-2]，流行范圍很廣，尤其近年AI疫情呈現(xiàn)上升趨勢，給主要養(yǎng)禽國家造成巨大經(jīng)濟損失[3]，自上世紀(jì)90年代香港禽流感事件以來[4]，AI的公共衛(wèi)生學(xué)意義發(fā)生了質(zhì)的改變，AI不但得到廣大學(xué)者的關(guān)注，而且已引起了包括聯(lián)合國在內(nèi)的世界各國政府的高度重視?？v觀對AI已有的研究資料，主要集中在病原學(xué)、流行病學(xué)、特異性診斷、DNA序列分析和疫苗研制等方面[5-7]。在宿主抗AIV免疫反應(yīng)機制方面，只見于人和小鼠的少量報道[8-9]，對SPF雛雞感染AIV后外周血液體液免疫和細胞免疫變化的全面系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，本項目以21日齡SPF雛雞為研究對象，應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫酶組織化學(xué)等方法，對AIV感染21日齡SPF雛雞外周血IgG、IgM和IgA含量，T、B淋巴細胞數(shù)量及其對ConA或PMA的增殖反應(yīng)進行了較全面系統(tǒng)的檢測，旨在為進一步探討流感病毒的免疫致病機制，為其獸醫(yī)臨診綜合防治提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

21日齡CSIRO-MVS品系SPF雛雞70只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。

1.1.2 禽流感病毒（AIV）

鵝源H5N1亞型AIV中強毒株，血凝價為26，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室提供，并監(jiān)督使用。

1.1.3 主要試劑

酶標(biāo)羊抗兔IgG結(jié)合物（HRP-SARIgG），北京中山生物制品公司產(chǎn)品；兔抗雞IgG、IgM、IgA血清（RACIgS），本研究室制備；刀豆蛋白A（ConA）、乙酸豆寇佛波醇（PMA）、RPMI1640完全培養(yǎng)液和四甲基偶氮唑鹽（MTT）均為Sigma公司產(chǎn)品，按實驗要求配成相應(yīng)使用液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

70只SPF雛雞隨機分為AIV感染組（簡稱I組）和對照組（簡稱C組），每組35只雛雞。其中I組雛雞經(jīng)點眼、滴鼻和口感染1∶100稀釋的AIV稀釋液0.1 mL·只-1；C組雛雞經(jīng)上述相同途徑給予高壓消毒的 0.01 mol·L-1PBS 0.1 mL·只-1，兩組雛雞分別飼養(yǎng)于禽病感染實驗室的負壓隔離器內(nèi)，嚴(yán)格按照高致病性禽流感實驗要求和SPF動物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)管理。

1.2.2 被檢材料

兩組雛雞分別于AIV感染后1、3、4、5、8、14和21 d，每組隨機抽取5只雛雞，心臟采血2 mL供外周血液T、B淋巴細胞數(shù)量及其增殖功能檢測，然后心臟采血處死雛雞，收集0.5 mL血清供IgG、IgM、IgA檢測用。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 外周血液T、B淋巴細胞數(shù)量測定

采用免疫SPA菌體花環(huán)法。

1.3.2 血清IgG、IgM、IgA含量測定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（Indirect enzymelinked immunosor-bent assay，iELISA）法。

1.3.3 外周血液T、B淋巴細胞增殖功能測定

1.3.3.1 淋巴細胞懸液制備

無菌采取外周血液，以淋巴細胞分離液密度梯度離心法（2 000 r·min-1，20 min）分離淋巴細胞，再用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌（1 500 r·min-1，10 min）淋巴細胞3次，臺盼蘭拒染法檢測細胞活率＞95%，并進行細胞計數(shù)，用RPMIl640完全培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至 2×107個·mL-1。

1.3.3.2 T、B淋巴細胞增殖功能測定——細胞培養(yǎng)及MTT法

96孔微量培養(yǎng)板，每孔加入50 μL含ConA（80 μg·mL-1ConA）或 PMA（1 200 ng·mL-1PMA）的RPMI1640完全培養(yǎng)液，對照孔只加RPMI1640完全培養(yǎng)液，再加淋巴細胞懸液50 μL，培養(yǎng)物總體積為 100 μL，細胞終濃度為 1×107個·mL-1，刺激孔的ConA、PMA終濃度分別為40、600 ng·mL-1，對照孔無ConA或PMA，每組設(shè)3個重復(fù)。細胞培養(yǎng)板置40℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)21 h。然后每孔加5mg·mL-1MTT溶液10μL，再繼續(xù)培養(yǎng)3h。每孔加入 10%SDS-0.01 mol·L-1HCl溶液 100 μL，置細胞培養(yǎng)箱中8 h，然后取出以空白孔調(diào)零。測定每孔OD590的OD值，結(jié)果以淋巴細胞轉(zhuǎn)化率表示。

T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率=ConA或PMA刺激孔平均OD值/對照孔平均OD值

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Minitab軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，經(jīng)t檢驗分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIV感染21日齡SPF雛雞血液體液免疫功能變化

2.1.1 AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量的動態(tài)變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后1～4 d明顯低于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01），第5天后開始逐漸升高，8～21 d顯著高于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）；IgM含量于第4天開始增加，5～8 d顯著或極顯著高于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）；而IgA含量在病毒感染后4 d內(nèi)顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），5～8 d病毒感染雛雞較對照雛雞明顯增加（P＜0.05），其余未見統(tǒng)計學(xué)差異（見表 1）。

2.1.2 AIV感染21日齡SPF雛雞外周血液B淋巴細胞數(shù)量及其對PMA增殖功能變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液B淋巴細胞數(shù)量除第1天明顯高于對照雛雞（P＜0.05）外，3～14 d均顯著或極顯著（P＜0.05或 P＜0.01）低于對照雛雞；B淋巴細胞對PMA的增殖反應(yīng)于病毒感染后 3～8 d明顯減弱（P＜0.05或 P＜0.01），其他除第1天外，其余盡管病毒感染雛雞較對照雛雞增加，但未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（見表 2）。

表1 AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量變化Table 1 Changes of the immunoglobulin（Igs）content in serum of 21-day-old chickens infected with AIV （OD492）

表2 AIV感染21日齡SPF雛雞血液B淋巴細胞數(shù)量及其增殖反應(yīng)變化Table 2 Changes of the number and proliferative responses to PMA of B lymphocytes in blood of 21-day-old chickens infected with AIV

2.2 AIV感染SPF雛雞外周血液細胞免疫功能變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后1～14 d，其外周血液T淋巴細胞數(shù)量較對照雛雞顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；T淋巴細胞對ConA的增殖反應(yīng)于病毒感染后3～14 d明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其余未見統(tǒng)計學(xué)差異（見表3）。

表3 AIV感染21日齡SPF雛雞血液T淋巴細胞數(shù)量及其對ConA增殖反應(yīng)變化Table 3 Changes of the number and proliferative responses to ConA of T lymphocytes in blood of 21-day-old chickens infected with AIV

3 討 論

本研究應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)和免疫酶組織化學(xué)方法對21日齡SPF雛雞人工感染鵝源H5N1亞型中強毒AIV后，其外周血液的IgG、IgM、IgA含量，T、B淋巴細胞數(shù)量及其對ConA或PMA增殖功能的動態(tài)變化進行動態(tài)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21日齡SPF雛雞感染H5N1亞型AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后1～4 d明顯低于對照雛雞，隨后開始逐漸升高；IgM含量于5～8 d顯著或極顯著高于對照雛雞；而IgA含量在病毒感染早期顯著降低，5～8 d較對照雛雞明顯增加。外周血液B淋巴細胞數(shù)量于病毒感染后3～14 d顯著或極顯著低于對照雛雞；B淋巴細胞對PMA的增殖反應(yīng)于病毒感染后3～8d明顯減弱。表明AIV感染雛雞外周血液的體液免疫功能受到一定程度抑制。據(jù)報道[10]，雞自然感染AIV后第3天已有HA特異性抗體的產(chǎn)生，并且可維持較高水平。在抵御流感病毒感染中，以B淋巴細胞為主的體液免疫發(fā)揮了十分重要的作用。B淋巴細胞在致敏Th細胞及其分泌的某些細胞因子（如IL－1、B細胞生長因子、B細胞分化因子、IL－2等）作用下，分化發(fā)育為漿細胞，分泌T細胞依賴性（TD）抗體。Walter等研究發(fā)現(xiàn)[11]，T淋巴細胞缺陷小鼠流感病毒感染后也可誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，表明流感病毒可不依賴于T細胞輔助抗體應(yīng)答，稱為T細胞非依賴性（TI）抗體應(yīng)答，該抗體通常只產(chǎn)生IgM型抗體，而且不發(fā)生抗體類別轉(zhuǎn)換，且無記憶反應(yīng)。進一步研究表明，上述兩種抗體均能在一定程度上降低流感病毒感染動物的死亡率，但TD抗體對機體的保護比TI抗體更有效[12]。Kostolansky等試驗發(fā)現(xiàn)[13]，小鼠自然感染AIV后，可引起強烈的抗HA2抗體應(yīng)答，表明AIV的HA2可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生清除病毒的抗體。

本研究還發(fā)現(xiàn)，21日齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液T淋巴細胞不但數(shù)量較對照雛雞顯著或極顯著減少，而且T淋巴細胞對ConA的增殖反應(yīng)于病毒感染后3～14 d也明顯降低，表明AIV感染可顯著降低SPF雛雞外周血液的細胞免疫功能。王穎彥等報道[9]，感染H5N1病毒小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞數(shù)量下降，脾臟中T細胞數(shù)量下降趨勢與血液相同，AIV感染對T淋巴細胞數(shù)量影響較大，特別是CD8+T淋巴細胞受損害更為明顯。另有研究發(fā)現(xiàn)[14]，在AIV感染急性期T、B淋巴細胞數(shù)量均減少，但不改變CD4+與CD8+T細胞比率，T淋巴細胞對PHA和ConA的應(yīng)答降低，表明AIV可抑制細胞免疫功能。雞、雉雞人工或自然感染高致病性禽流感病毒后，其胸腺、法氏囊和脾臟等器官均呈現(xiàn)壞死性炎[15－17]，由于病毒感染使免疫器官發(fā)生變性、壞死，不但導(dǎo)致淋巴細胞數(shù)量明顯減少，而且淋巴細胞對有絲分裂原的應(yīng)答功能也顯著降低。本項目的另一部分研究也發(fā)現(xiàn)[18]，AIV感染SPF雛雞后，其胸腺、法氏囊和脾臟等免疫器官的T、B淋巴細胞對ConA或PMA的增殖反應(yīng)在一定時間內(nèi)明顯下降，但兩者的程度并不相同，其中T淋巴細胞對有絲分裂原的反應(yīng)性較B淋巴細胞降低尤為明顯。AIV感染SPF雛雞后，其外周血液的細胞免疫和體液免疫功能下降是機體免疫器官免疫功能低下的外在表現(xiàn)，而免疫器官免疫功能的減弱或喪失是外周血液免疫功能改變的基礎(chǔ)或根源。

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