鴨副粘病毒與H9亞型禽流感病毒雙重PCR檢測方法的初步建立

劉宇卓，魏雪濤，李 銀，張敬峰

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，南京 210014；3.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）所引起的禽類疾病[1]，是一種嚴(yán)重威脅全世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。1994年我國學(xué)者陳伯倫從發(fā)病蛋雞分離到H9N2亞型AIV。此后，H9N2亞型AIV在我國被廣泛報道，多呈低致病性感染，并呈逐漸蔓延之勢。鴨、鵝等水禽一直被認(rèn)為是AIV巨大的基因儲存庫，其充當(dāng)著流感病毒由野生水禽到陸生禽類傳播過程中間媒介的作用。但近年來，H9N2亞型禽流感對水禽感染毒性增強(qiáng)[2-4]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病病原之一，該病毒為禽副粘病毒科副粘病毒屬病毒，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。過去一般認(rèn)為水禽（如鵝、鴨等）對NDV的易感性較差，多呈隱性感染。而自20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外愈來愈多的報道顯示NDV對水禽的致病力逐漸增強(qiáng)，鵝、鴨等水禽已成為易感禽類[5-7]。鴨的副粘病毒病和鴨的H9亞型禽流感感染在臨床表現(xiàn)及剖檢癥狀上有很多相似的地方，給臨床診斷帶來很多困擾，嚴(yán)重影響疫病的診治和預(yù)防，因此，本文探索對這兩種病原進(jìn)行雙重PCR檢測，一次性對兩種病原進(jìn)行檢測，縮短臨床診斷時間，提高敏感性及特異性，同時亦可用于鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 病毒

雞源H9亞型禽流感病毒（AIV H9）、鴨副粘病毒（DPV）、雞新城疫病毒（NDV）、鴨源H9亞型禽流感病毒（AIV H9）、雛鴨病毒性肝炎病毒（DHV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBVP）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）均為江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所家禽重大疫病防控項目組保存。

1.2 試劑

PCR試劑盒、pMD18-T載體、常用工具酶以及凝膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司；LB培養(yǎng)基、Trizol抽提試劑、焦碳酸二乙酯（DEPC）購自Invotrizen公司；氨芐青霉素為Promaga公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的兩種病毒基因序列，選擇核苷酸保守序列，利用primer6.0分析軟件，設(shè)計了2對特異性引物，由TaKaRa公司合成。

1.4 雙重RT-PCR檢測方法的建立

1.4.1 RNA的提取

取已知H9亞型AIV和DPV兩種病毒混合尿囊液，同時分別以兩種病毒作為陽性對照，10 000 r·min-1離心30 min，取上清液每管依次加入Trizol 800 μL，振蕩混勻，室溫放置10 min，加入氯仿200 μL，劇烈振蕩后，室溫放置1 min，4℃12 000 r·min-1，離心 15 min，取上層水相 750 μL，加入500 μL異丙醇，混勻，-20℃放置15 min，4℃10 000 r·min-1離心1 min，去上清，緩緩加入75%乙醇1 mL洗滌，4℃ 8 000 r·min-1離心5 min，去上清，室溫干燥20 min，加入DEPC水10 μL，使充分溶解。

1.4.2 雙重RT-PCR

1.4.2.1 反轉(zhuǎn)錄 （RT）

5×AMV Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTPs 2 μL、兩對反轉(zhuǎn)錄引物各1 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、RNA 模 板 10 μL，AMV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 0.5 μL，H2O（DEPC 處理）1 μL，總體積為 20 μL，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15 min，42℃孵育1 h，95℃5 min，同時設(shè)立陰性、陽性對照，產(chǎn)物置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.2 PCR

按25 μL體系進(jìn)行。在PCR反應(yīng)管中分別加入：含 MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，滅菌水 14 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 4 μL，10×EX TaqDNA聚合酶buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，兩種上、下游引物 50 pmol·μL-1各 0.5 μL，EX TaqDNA 聚合酶0.5 μL。94℃ 3 min，然后進(jìn)入循環(huán) 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)，于72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120 V，時間30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，并進(jìn)行拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物序列測定和分析

切割回收目的片段，然后按凝膠回收試劑盒說明書所示方法純化回收PCR產(chǎn)物。按pMD18-TVector說明加入連接體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆菌由南京基天生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，并對基因序列用DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和分析。

1.5 雙重RT-PCR特異性試驗

取RNA病毒DHV、IBV、IBDV尿囊液，同時取H9亞型AIV、DPV及其混合物作為陽性對照，滅菌水作為空白對照，按上述方法提取RNA，用兩對特異性引物進(jìn)行雙重RT-PCR，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察結(jié)果。

1.6 雙重RT-PCR敏感性試驗

取含H9亞型AIV及含DPV的尿囊液，分別測定病毒液的雞紅細(xì)胞凝集價（HA），以相同的HA價為基礎(chǔ)，分別10倍倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，并測定對應(yīng)濃度下 RNA 含量，將相同的稀釋度混合為一個樣品，提取RNA，并用建立的雙重RT-PCR方法對上述各定量樣品進(jìn)行測定，比較檢測血凝效價為0的樣品及最低稀釋度毒液的RNA濃度，研究雙重RT-PCR方法的敏感性，同時與HA方法進(jìn)行比較。

1.7 雙重RT-PCR穩(wěn)定性研究及應(yīng)用

1.7.1 待檢樣品

取-20℃保存不同時間NDV及H9亞型禽流感病毒尿囊液；取病死或攻毒后死亡鴨，采集鴨肺臟、脾臟、肝臟等組織；用棉拭子采集攻毒后存活鴨喉頭分泌物，置30%甘油生理鹽水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 待檢樣品處理

取-20℃保存2、4和12個月的ND及H9亞型禽流感病毒尿囊液，凍融2次；取待檢病料置無菌研缽中剪碎并研磨，按1∶3加入滅菌生理鹽水，將保存的喉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子。均4℃ 12 000 r·min-1，離心10 min，取上清。

1.7.3 雙重RT-PCR

取上述待檢材料，分別提取RNA，并按已建立的方法進(jìn)行雙重RT-PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重RT-PCR的建立

2.1.1 雙重RT-PCR的反應(yīng)條件優(yōu)化

按方法中條件進(jìn)行RT-PCR。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120 V，時間30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，并進(jìn)行拍照。試驗結(jié)果如圖1所示。由PCR產(chǎn)物的電泳圖可知，一次性擴(kuò)增出兩條目的條帶：大小為732 bp的H9亞型AIV，大小為363 bp的DPV，均與預(yù)期目的條帶相符。

2.1.2 目的片段的克隆和測序

切取目的片段進(jìn)行膠回收，克隆、轉(zhuǎn)化后進(jìn)行陽性質(zhì)粒篩選、測序。測序結(jié)果與GenBank上公布的兩種病毒的序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)96%～99%。

2.2 雙重RT-PCR特異性試驗

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知：用已建立的雙重RT-PCR方法，不但AIV H9與DPV混合液出現(xiàn)兩條特異性條帶，AIV H9與DPV均在相對應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，而其他病毒及空白對照均未出現(xiàn)條帶，表明該方法具有特異性。

圖1 雙重RT-PCR方法的建立Fig.1 Duplex RT-PCR amplification of two virus gene

圖2 雙重RT-PCR特異性試驗Fig.2 Specificity test of duplex RT-PCR products

2.3 雙重RT-PCR敏感性試驗

取H9亞型AIV、DPV，以相同的血凝價為基礎(chǔ)，10倍倍比稀釋至10-7，分別提取RNA，并檢測血凝效價為0的樣品的RNA濃度，分別進(jìn)行RT-PCR。試驗結(jié)果顯示，稀釋到10-4的病毒液的HA效價為0，而用RT-PCR方法，無論其中一種病毒檢測還是混合病毒檢測均可以檢出稀釋到10-5的病毒液（見圖3）。說明該方法敏感性高于常規(guī)的HA檢測方法100倍以上。經(jīng)測定10-5病毒液的RNA濃度為2 ng·μL-1，因此該方法可檢測的最小病毒核酸量為 2 ng·μL-1。

圖3 雙重RT-PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of duplex RT-PCR products

2.4 雙重RT-PCR的穩(wěn)定性及應(yīng)用

取-20℃保存2、4和12個月的陽性NDV、DPV及不同H9亞型AIV尿囊液，提取RNA并進(jìn)行雙重RT-PCR，均能擴(kuò)增出特異性條帶。

對臨床疑似病例及攻毒死亡禽組織進(jìn)行雙重RT-PCR方法檢測，同時采用雞胚分離方法進(jìn)行對比，陽性符合率達(dá)100%。

3 討論與結(jié)論

1966年Hommee和Esterday第一次在美國威斯康辛的火雞中分離到H9亞型禽流感病毒[8-9]，此后該亞型病毒不斷的在雞群尤其是火雞群中流行。進(jìn)入90年代，H9亞型禽流感病毒呈廣泛流行趨勢，危害日趨嚴(yán)重。1995～1999年，在德國及意大利、愛爾蘭、南非、美國、韓國等多個國家的多種禽類中均有發(fā)生[10]。1994年國內(nèi)由陳伯倫等首次分離到H9N2亞型禽流感病毒[11]。之后的幾年里，H9N2亞型禽流感在我國家禽中廣泛流行，危害日趨嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計，1996～2000年間，我國H9N2型禽流感占感染雞群的93.89%，成為影響?zhàn)B禽業(yè)的主要病害。

H9N2亞型禽流感病毒還可感染人，具有重要的公共衛(wèi)生意義。1999年，Peiris等在香港分離到了人源H9N2亞型流感分離株（A/HK/1073/99）[12]，同年郭元吉等人對深圳人群作流感的血清學(xué)監(jiān)測，從19%的人體中分離到H9N2亞型流感病毒[13]。因此，開展針對H9亞型禽流感病毒的快速診斷及相關(guān)研究顯得尤為重要。

PCR是一種高度特異、靈敏的方法，在疾病的診斷上有著較為廣泛的應(yīng)用。因所設(shè)計合成的引物具有針對性，其反應(yīng)具有特異性、敏感性、穩(wěn)定性的特點(diǎn)，檢測效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)驗室傳統(tǒng)的一些常規(guī)檢測方法。隨著PCR實(shí)驗室技術(shù)的日益成熟而越來越受到歡迎，已被廣泛地應(yīng)用于檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查等方面。本檢測方法的建立是基于DPV及H9亞型AIV兩種病毒的RT-PCR檢測方法[6,14]，利用一次PCR，對兩種流行病混合感染進(jìn)行診斷，也可以用于檢測其中的某一種病毒。本研究所建立的雙重RT-PCR方法，由試驗結(jié)果可知其敏感性良好，對兩種病毒的最低檢測含量均為2 ng·μL-1，是血凝試驗的100倍。同時該方法具有較強(qiáng)的特異性，可以特異性地檢測出DPV、H9亞型AIV或同時檢出此兩種病毒，卻不能檢出DHV、IBDV、IBV等。

本試驗從含毒尿囊液、發(fā)病死亡禽組織臟器中提取總RNA，進(jìn)行雙重RT-PCR檢測，與用雞胚分離病毒結(jié)果相符，而采集攻毒后喉拭子進(jìn)行PCR檢測與雞胚分離比較結(jié)果卻不理想，較雞胚分離陽性結(jié)果相去甚遠(yuǎn)。分析原因，可能是拭子中病毒的含量極低，用雞胚分離，通過數(shù)天的增殖可逐漸地達(dá)到一定的病毒量，而PCR方法需要一定的起始病毒量作為模板。因此，條件允許的情況下，可以采用雙重RT-PCR方法檢測經(jīng)雞胚分離培養(yǎng)的尿囊液及發(fā)病死亡家禽的組織臟器的病毒核酸，從而進(jìn)行診斷。由于鴨副粘病毒及H9亞型禽流感病毒均具有血凝特性，因此采用該方法不僅操作簡便、特異性強(qiáng)，而且對鑒別診斷具有極高的應(yīng)用價值。

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