三種中藥復(fù)方對鯉幼魚生長及免疫性能的影響

蘇 嶺，劉紅柏，王 荻，盧彤巖，尹家勝

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

當(dāng)前水產(chǎn)動物疾病控制多集中在發(fā)病后的治療上，花費成本高，爆發(fā)性疾病治愈率低。長期使用或不當(dāng)使用化學(xué)藥物，不僅造成動物細(xì)胞免疫和體液免疫功能下降，也使人類的健康和安全受到殘留于水產(chǎn)品中藥物的威脅等諸多問題。隨著人民生活水平的顯著提高和科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對疾病治療的觀念也發(fā)生了巨大的轉(zhuǎn)變。控制疾病的關(guān)鍵正在從對外源性病原菌的直接殺傷向調(diào)節(jié)生物自身功能以提高對病害的免疫轉(zhuǎn)變。

用中藥治療魚病殘留少，致病菌不易產(chǎn)生耐藥性，不僅對病原微生物有直接的抑制和殺滅作用，更重要的是可以對魚類的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，提高水產(chǎn)動物的抗應(yīng)激能力和免疫機能，符合當(dāng)下健康無公害水產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。

中藥種類眾多，針對不同機體和作用目的可以進(jìn)行多種組方，為促進(jìn)生長及增強機體免疫功能防治疾病提供了多種選擇。吳德峰等發(fā)現(xiàn)中草藥作為飼料添加劑對歐鰻有很好的增重效果，同樣條件下不但節(jié)約成本增重明顯，同時對肌肉營養(yǎng)成分的分析也表明對肉質(zhì)營養(yǎng)成分也有改善作用[1]。錢續(xù)等發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)合添加劑對虹鱒增重明顯且能降低餌料系數(shù)[2]。蔡中華等研究了黃連、大黃、無花果及花粉對鯉魚非特異性免疫功能的影響，其結(jié)果顯示，除無花果外，黃連、大黃及花粉都對鯉魚的非特異性免疫功能具有增強作用[3]。簡紀(jì)常等研究表明中草藥既能明顯提高建鯉的吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，又能提高其溶菌酶的活力，從而明顯提高建鯉的非特異性免疫能力[4]。本試驗采用自組復(fù)方，研究中藥對鯉魚的生長及抗病力等方面的影響，篩選最優(yōu)組方，為中藥在鯉魚這一極具普遍性的養(yǎng)殖品種的應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中藥均購自哈爾濱世一堂藥店，烘干后備用。健康非免疫狀態(tài)下鯉魚購自黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗站，平均體重85.88±2.45 g。

1.2 方法

1.2.1 中藥方劑的制備

試驗所用中藥購自哈爾濱世一堂藥店，配伍成三個復(fù)方制劑：復(fù)方AB由甘草、紫草等組成；復(fù)方AH由生雞內(nèi)金、生牡蠣、山藥等組成；復(fù)方CD由茵陳、板藍(lán)根、黃芩等組成。

按照各復(fù)方配比稱取中藥，放入砂鍋中，加水浸泡30 min，第一次熬45 min，將藥汁倒出，再加水熬20 min，過濾，將兩次藥汁合并，定容，濃度分別為 AH 0.26 g·mL-1，CD 0.227 g·mL-1，AB 0.367 g·mL-1，經(jīng)高溫高壓滅菌后存放于4℃冰箱中備用。

1.2.2 試驗魚的飼養(yǎng)

試驗包括三個中藥組和一個對照組，每組設(shè)一個平行。試驗魚于室內(nèi)水族箱（100 cm×30 cm×50 cm）中養(yǎng)殖，每箱20尾，各箱魚平均體重相似，水族箱配備蓄水池，循環(huán)過濾泵及充氣泵，水溫20℃，維持相同的養(yǎng)殖環(huán)境。試驗期間每天按照魚體重的2.0%投喂基礎(chǔ)飼料。鑒于實驗室之前試驗口灌比制成顆粒料喂養(yǎng)吸收更充分的結(jié)果，參照復(fù)方中各藥材的日常人體保健用量，每天取中藥水煎劑藥液按照每100 g魚體灌服0.3 mL的量口灌一次，連續(xù)口灌四周。喂養(yǎng)第29日，稱重后于平行的兩個水族箱中任選一箱，對其中魚體胸鰭下注射細(xì)菌性抗原（本實驗室篩選的溫和型嗜水氣單胞菌），細(xì)菌濃度為1×107個·mL-1，注射劑量為每100 g魚體重0.2 mL菌液。

1.2.3 樣品采集

喂養(yǎng)第30日對全部試驗魚統(tǒng)一采樣。尾部采血，4℃，3 500 r·min-1離心15 min，取血清保存于-80℃待測。采集肝臟，保存于-80℃待測。

1.2.4 指標(biāo)檢測

1.2.4.1 生化指標(biāo)檢測

采用Beckman公司生產(chǎn)的CYNCHRON CH4PRO全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。檢測指標(biāo)包括：總蛋白，白蛋白，谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶，堿性磷酸酶，甘油三酯，總膽固醇，乳酸脫氫酶，尿素氮，肌酐，葡萄糖，鐵。

1.2.4.2 C3、C4補體檢測

使用補體3，補體4檢測試劑盒（購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司）檢測補體指標(biāo)。

1.2.4.3 NO、NOS檢測

使用購自南京建成的一氧化氮試劑盒（硝酸還原酶法）和一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒檢測血清及肝臟勻漿的NO、NOS含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

該試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件中的單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計，Duncan′s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 增重率

經(jīng)28日飼養(yǎng)，三個中藥組增重率與對照組相比均有顯著差異（P＞0.05）；處理組中，CD增重效果最好，顯著高于AH和AB組（見表1）。

表1 鯉魚增重率Table 1 Growth rate of Cyprinus carpio

2.2 中藥方劑對鯉魚血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白以及白球比例的影響

由表2可以看出，灌服中藥方劑AB的試驗組在未接受細(xì)菌性抗原刺激時，血清中總蛋白（TP）及白蛋白（ALB）的含量顯著高于對照組（P＜0.05），各組間均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 中藥方劑灌服后鯉魚血清中各種蛋白含量Table 2 Contents of different proteins in serum of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal (g·L-1)

接受細(xì)菌性抗原刺激后，AH、AB兩組血清中總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）以及球蛋白（GLB）含量均顯著高于對照組和CD組（P＜0.05）。

2.3 中藥方劑對鯉魚血清中堿性磷酸酶，乳酸脫氫酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶含量的影響

表3顯示三種中藥灌服鯉魚后，在未被細(xì)菌性抗原刺激情況下谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量AH組最高，但是乳酸脫氫酶（LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量 4組之間無顯著差異（P＞0.05）。唯有堿性磷酸酶（AKP）的含量AH和AB組顯著高于對照組和CD組（P＜0.05）。

在接受細(xì)菌性抗原刺激后AH組魚的堿性磷酸酶（AKP）含量顯著高于其余三組（P＜0.05），乳酸脫氫酶（LDH）含量卻顯著低于其余三組的（P＜0.05）。對照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量顯著高于3個處理組（P＜0.05）。AB組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量最低，AH組谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量最低。

表3 不同中藥方劑灌服后未被注射抗原組鯉魚血清中各種酶含量Table 3 Contents of different enzymes in serum of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal(IU·L-1)

2.4 中藥方劑對鯉魚血清中甘油三酯、總膽固醇、尿素氮及肌酐含量的影響

甘油三酯（TG）含量的情況與是否用細(xì)菌性抗原刺激無關(guān)，灌服中藥組含量均高于對照組和CD組，但是差異不顯著（P＞0.05），如表4所示；在細(xì)菌性抗原刺激前、后，總膽固醇（CHOL）的含量對照組與處理組均無顯著差異；注射細(xì)菌性抗原前，CD組尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的含量顯著高于對照組。注射細(xì)菌性抗原后，中藥組尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的含量均明顯高于對照組。

表4 不同中藥方劑灌服后鯉魚血清中甘油三酯、總膽固醇、尿素氮及肌酐含量的變化Table 4 TG and CHOL and BUN and Scr contents in serum of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal compound (IU·L-1)

2.5 不同中藥方劑對鯉魚血清中尿酸，葡萄糖以及血清鐵含量的影響

從表5可以看出抗原刺激前、后，CD組鯉魚血清中葡萄糖（GLU）的含量均顯著高于AH組、AB組和對照組（P＜0.05）。AH組和AB組與對照組的含量接近。沒有細(xì)菌性抗原刺激時對照組和AH組鯉魚血清中鐵（Fe）的含量顯著高于CD和AB組；刺激后，AH組和AB組血清鐵（Fe）的含量有所升高，顯著高于對照組和CD組（P＜0.05）。對照組的含量變化最大，降為最低。

表5 中藥方劑灌服后鯉魚血清中血糖及血清鐵含量的變化Table 5 GLU and Fe contents in serum of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal compound

2.6 不同中藥方劑對鯉魚血清中補體的影響

由表6可以看出，在沒有細(xì)菌性抗原刺激時，三個中藥組補體3和補體4的含量均顯著高于對照組的含量（P＜0.05）。注射細(xì)菌性抗原后，補體4的含量依然是處理組高于對照組，而中藥組中補體3的含量與對照組差異不顯著。

表6 中藥方劑灌服后鯉魚血清中C3,C4含量的變化Table 6 C3 and C4 contents in serum of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal compound (g·L-1)

2.7 不同中藥方劑對鯉魚血清及肝臟中NO、NOS含量的影響

結(jié)果見表7。

處理組鯉魚血清中NO的含量在抗原刺激前、后均顯著高于對照組量（P＜0.05），三種復(fù)方作用的組間沒有顯著差異（P＞0.05）；肝臟中唯有注射細(xì)菌性抗原時，AB組的NO含量顯著升高（P＜0.05），其余各處理間均沒有顯著差異（P＞0.05）。

表7 中藥方劑灌服后鯉魚血清及肝臟中NO含量的變化Table 7 NO contents in serum and liver of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal compound(μmol·g-1prot)

表8顯示，灌服中藥后，鯉魚血清內(nèi)的TNOS和iNOS含量產(chǎn)生了顯著的變化，AB組高于剩余三組，而肝臟內(nèi)TNOS和iNOS的含量沒有出現(xiàn)顯著的變化，四組數(shù)值相近。給試驗魚注射細(xì)菌后，各處理組血清中TNOS的含量顯著高于對照組，AH組的iNOS含量顯著低于其它組。四組肝臟中TNOS含量注射細(xì)菌前、后均無顯著差異，而iNOS含量處理組注射細(xì)菌后顯著高于對照組。

表8 中藥方劑灌服后鯉魚血清及肝臟中NOS含量的變化Table 8 NOS contents in serum and liver of Cyprinus carpio fed with different Chinese medicinal herbal compound(U·mg-1prot)

3 討論與結(jié)論

3.1 中藥對鯉魚生長性能的影響

研究表明，中草藥含有大量的生物堿、揮發(fā)油、苷類、有機酸、鞣質(zhì)、多糖等，而且還含有一定量的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、礦物質(zhì)、維生素、油脂、植物色素等營養(yǎng)物質(zhì)。這些成分可以對動物機體產(chǎn)生營養(yǎng)作用，促進(jìn)新陳代謝和蛋白質(zhì)、酶的合成，從而加速生長發(fā)育。

關(guān)于中藥促進(jìn)機體生長代謝作用的報道很多[5-7]，但因功效和組成不同，中藥的促生長效果并不相同。本試驗三種方劑均能顯著提高鯉魚的增重率，尤其是CD組方劑又優(yōu)于AH和AB組方劑，增重率與對照組相比，快一倍還要多。目前有很多關(guān)于黃芪促生長的報道[8-10]，CD方劑中含有黃芪，很有可能是這個原因造成了CD組鯉魚增重最明顯的結(jié)果。

3.2 中藥對鯉魚生化指標(biāo)的影響

同其他脊椎動物一樣，魚類也是通過免疫系統(tǒng)來抵御外來病原生物的侵害，通過非特異性和特異性免疫防御機制來維持機體的正常功能與自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。內(nèi)環(huán)境中各種酶和離子的含量決定了機體對刺激的耐受能力，是免疫力強弱的標(biāo)志。一些研究表明，中藥可以調(diào)節(jié)機體各項免疫和生理生化指標(biāo)，進(jìn)而影響免疫力[11-12]。本試驗采用的三種方劑在不同程度上起到了這樣的作用。

血清白蛋白（ALB）由肝臟合成，作為營養(yǎng)物質(zhì)的載體同時還維持血漿滲透壓，并作為機體蛋白質(zhì)的一個來源，用于修補組織和提供能量[13]。本試驗結(jié)果顯示，在自然健康狀態(tài)下，三種中藥方劑均能提高鯉魚血清中總蛋白（TP）以及白蛋白（ALB）的含量，有利于蛋白質(zhì)加速合成，這與他們能顯著促進(jìn)生長相一致。細(xì)菌入侵后，AH和AB兩種方劑灌服的鯉魚血清中球蛋白（GLB）也有了顯著升高，而球蛋白中含有r球蛋白，對機體的免疫具有促進(jìn)作用，因此很可能這兩種復(fù)方方劑在免疫促進(jìn)方面效果較明顯。

堿性磷酸酶（AKP）存在于機體的各個組織，以肝臟、腎臟較多，是機體生長代謝、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的酶。許多因素能影響魚類AKP水平的變化[14]，中藥作為一種免疫增強劑對AKP的影響也值得探討。本試驗中AH和AB兩種復(fù)方制劑對AKP有明顯的提升作用。一些研究報道的中藥促進(jìn)生長代謝加速生長的作用的原因之一可能正是AKP水平的變化。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（CHOL）都是反應(yīng)肝功能的指標(biāo)，主要存在于肝臟中，只有當(dāng)肝組織受損時才會大量轉(zhuǎn)入血清中。試驗中正常情況下方劑組和對照組中每種酶的含量都沒有顯著的差別。而在有病原菌入侵時，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）這種肝臟細(xì)胞中參與氨基酸代謝的一種轉(zhuǎn)氨基活性最高的酶在對照組中的含量要顯著高于三種中藥方劑組，這可能是中藥保護(hù)肝臟受到較少的損傷的緣故。這一點可由測得的中藥組鯉魚血清白蛋白含量高于對照組證實。正因為中藥能保護(hù)肝臟，所以由肝臟產(chǎn)生的白蛋白才會增多。

血清肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）主要由腎小球濾過排出，測定血清肌酐和尿素氮，可反映腎小球的濾過功能[15]。三種方劑沒有降低反而升高了血清中肌酐和尿素氮的含量，很有可能是對魚體腎臟功能產(chǎn)生了不良影響。張志清等[16]，鄭芳等[17]關(guān)于中藥對人體腎毒性方面做過分析，中草藥本身的腎毒性，中草藥引起的過敏反應(yīng)，過量或長期應(yīng)用等這些因素都可造成腎臟損傷。具體到本試驗究竟是哪種原因造成的損傷還有待研究。

3.3 中藥對鯉魚某些非特異性免疫功能的影響

補體作為魚類免疫系統(tǒng)的重要組成成份，在魚類免疫系統(tǒng)進(jìn)化過程中比免疫球蛋白出現(xiàn)的要早[18]，是非特異性免疫因素之一，對各種細(xì)菌、病毒、寄生蟲的感染均有反應(yīng)，主要功能是促進(jìn)免疫功能的發(fā)揮，增強免疫效應(yīng)。從得到的結(jié)果看，三種中藥組與對照組相比C3和C4含量均有了顯著的提高，起到了增強免疫的功效。

作為一種新發(fā)現(xiàn)的信使分子和免疫調(diào)節(jié)因子，NO的研究近年來得到廣泛發(fā)展[19-21]。NO的生物合成依賴于NOS。NOS有三種同工酶亞型：神經(jīng)元型NOS（nitronal NOS，nNOS，也稱 I型）；內(nèi)皮細(xì)胞型 NOS（endothelial NOS，eNOS，Ⅲ型）和誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS.iNOS，Ⅱ型），前兩種又稱為構(gòu)成型NOS（cNOS），含量較穩(wěn)定。iNOS主要在炎癥和免疫刺激下表達(dá)[22]。有研究表明，NO可抑制殺傷病毒、細(xì)菌、真菌以及寄生蟲的感染，在免疫中起著重要作用[19]，同時也有研究表明NO具有生理毒素，過量產(chǎn)生對機體有毒害作用[23]。本試驗對照組鯉魚在注射細(xì)菌性抗原刺激后，血清中NO的含量升高近一倍，而灌服中藥組血清中NO的含量升高較平緩，推測方劑可能具有緩解NO大量產(chǎn)生的作用，從而降低NO過量累積給機體帶來的傷害。但是未有細(xì)菌性抗原注射時，灌服中藥組鯉魚血清中NO的含量竟高達(dá)對照組中含量的4～6倍，是否對機體產(chǎn)生了損害還沒有結(jié)論。試驗測得NOS的結(jié)果沒有顯示出與NO含量的顯著正相關(guān)性，即NOS的含量沒有對應(yīng)NO的增長而增長，這可能是因為中藥復(fù)方也起到了調(diào)節(jié)NOS活力的作用，抑或是機體內(nèi)尚有別的NO合成途徑也未可知。在醫(yī)學(xué)界，已經(jīng)通過測量NO和NOS的高低作為評價人類疾病發(fā)生、發(fā)展以及衡量免疫水平高低的一個重要指標(biāo)。而在水產(chǎn)上，目前只能確定某種刺激會伴隨NO和NOS含量的某種改變[24－26]，而不能確定NO和NOS含量處于何種變動范圍對機體有利，這還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，試驗所選用的三種中藥復(fù)合方劑不同程度的提高了魚類的生長性能，也在一定程度上加強了免疫功能。就加速生長而言，CD組效果最明顯；就增強免疫性能而言，AB、AH組效果較好。中藥的作用很可能是雙向的，在提高代謝，增強免疫的同時，也會給肝、腎等組織造成負(fù)擔(dān)，在選擇用藥種類、用藥目的和用藥方式時應(yīng)予以注意。

*尹家勝教授是本文的同等貢獻(xiàn)者。

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