6株旋毛蟲49 ku ES抗原基因克隆及序列分析

路義鑫，韓彩霞，李曉云，董曉波，宋銘忻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

旋毛蟲?。═richinellosis）是一種重要的人獸共患寄生蟲病，主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的肉類所致。該病的流行不但對畜牧業(yè)、食品業(yè)及外貿(mào)出口造成了重大經(jīng)濟損失，而且對人類健康構(gòu)成威脅[1－2]。

旋毛蟲的抗原成分復(fù)雜，目前的研究熱點主要集中在排泄分泌（Excretory－secretory，ES）抗原。ES抗原中，主要的特異性蛋白成分有3種，分子質(zhì)量分別為45、49和53 ku，占ES總量的50%以上[3－4]。但在旋毛蟲ES抗原的研究中，幾乎所有學(xué)者都關(guān)注于T.spiralis（旋毛形線蟲），而對旋毛蟲屬其他種及基因型旋毛蟲研究甚少。不同種旋毛蟲在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等方面都存在差異[5－6]，那么在遺傳基因上包括編碼ES蛋白的基因序列是否存在差異，進(jìn)而可能在抗原性上也存在一定的差異呢？該基因能否作為分子標(biāo)記進(jìn)行分類學(xué)研究？為解決這些問題，本試驗以不同來源的6個旋毛蟲株為研究對象，克隆了不同種株旋毛蟲49 ku ES抗原基因并進(jìn)行序列比較分析，為該基因用于旋毛蟲病的免疫防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲種

試驗用各旋毛蟲株均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室提供的由昆明小鼠傳代保種的蟲體，詳見表1。

表1 劑量選擇與分組Table 1 Dose selection and group

將6株不同來源旋毛蟲（ISS3、ISS10、HC、HH、SW、MP）肌幼蟲，分別經(jīng)口感染5只成年健康昆明小鼠，感染劑量為每只小鼠200條活幼蟲，于感染40 d后將含旋毛蟲肌幼蟲的小鼠剖殺。人工胃液消化法收集蟲體，用蒸餾水反復(fù)洗滌干凈，備用。

1.2 主要試劑

胃蛋白酶（購自上海長城生化制藥廠）；DEPC（購自Sigma公司）；Trizol（購自Invitrogen公司）；DNA Marker、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、Rnase等均（購自大連寶生物工程有限公司）；小量膠回收試劑盒（購自上海華舜生物工程有限公司）；小量質(zhì)粒提取試劑盒（購自北京博大泰克生物技術(shù)有限公司）。

1.3 引物的設(shè)計

參考GenBank中T.nativa編碼49 ku ES基因序列（序列號AY486427.1），應(yīng)用Oligo 4軟件設(shè)計1對引物，UP：5′GC GAA TTC ATG GCT ACT GAT GAT ACA GAA TGG TT 3′，LOW：5′G CGG ATC CTT CTA TTA GCT GTA TGG GC 3′，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 旋毛蟲總RNA的提取

將約500條DEPC處理水洗滌3次的旋毛蟲肌幼蟲與Trizol液一起研磨，研碎蟲體后移入1.5 mL離心管中，補加Trizol液至800 μL，震蕩混合5 min，加入氯仿 200 μL，徹底混勻 2～3 min，12 000 r·min－1離心15 min，取上清并加入500 μL異丙醇，室溫放置 15～30 min，12 000 r·min－1離心 15 min，去上清并用濾紙吸干后用75%乙醇洗滌一次，離心并吸出乙醇，濾紙吸干離心管中殘液并放入37℃溫箱烘干，向管中加DEPC處理水20 μL，放于－70℃冰箱備用。

1.5 RNA反轉(zhuǎn)錄和目的基因擴增

首先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，然后以其為模板擴增目的基因。以20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取5 μL RNA樣品與1 μL下游引物混合，置70℃水浴吸附5 min，迅速冷卻后繼續(xù)加入 5×Buffer 4 μL，DTT 2 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，dNTP 2 μL，DEPC 水 4 μL，混勻后，置于 37℃水浴 1～1.5 h，70℃ 5 min（終止）。

取以上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（即cDNA），以25 μL體系進(jìn)行 PCR 擴增。cDNA 4 μL，Primer 1 μL（上、下游引物各 0.5 μL），10×Buffer 2.5 μL，dNTP 3 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 14 μL，混勻后置于 PCR 儀中擴增。PCR采用雙循環(huán)程序。95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸2 min（20個循環(huán)）；94℃變性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸2 min（25個循環(huán)）；72℃延伸8 min。

1.6 PCR產(chǎn)物克隆測序

擴增產(chǎn)物在10 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳，以DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步確定片段大小，在紫外燈下切下目的條帶，柱離心小量膠回收試劑盒純化后，按分子克隆的常規(guī)方法將目的片段與載體pMD－18T進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆菌測序，并進(jìn)行序列分析，與GenBank中的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因RT-PCR擴增

如圖1所示，各蟲樣PCR產(chǎn)物均在凝膠中擴增出目的條帶，在泳道2～6可見大小950 bp左右的特異條帶，這與預(yù)期擴增片段大小相吻合。目的片段與pMD18－T載體重組質(zhì)粒的PCR鑒定電泳圖譜見圖2。在泳道3～7重組質(zhì)粒樣品均擴增出長度為950 bp左右的目的條帶，與蟲體RT－PCR產(chǎn)物大小一致，基本確定為陽性重組質(zhì)粒。

圖1 目的基因的RT-PCR擴增電泳圖譜Fig.1 RT-PCR amplification of interest gene

2.2 序列分析

應(yīng)用DNAstar軟件將不同來源的6個旋毛蟲株49 ku ES抗原基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中的T.spiralis（P49）相應(yīng)基因序列（序列號M64242.1）進(jìn)行同源性比較，并比較6個蟲株間的同源性。

由表2可知，旋毛形線蟲（ISS3）和GenBank中的T.spiralis49 ku ES序列（P49）同源性為99.9%，僅在517位有一個堿基A→G的突變；旋毛形線蟲（ISS3）與本地毛形線蟲（ISS10）的同源性為97.8%；黑龍江豬株（HH）與ISS3的同源性為97.3%，與ISS10的同源性為99.1%；黑龍江犬株（HC）與ISS10的基因序列完全一樣，與ISS3同源性為97.8%；美國豬株（MP）與ISS3和ISS10的同源性分別為97.5%和99.6%；黑龍江貓株（SW）與ISS3和ISS10的同源性分別為97.6%和98.7%。從表2可見，根據(jù)旋毛蟲49 ku ES基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性都稍低于相應(yīng)的核苷酸序列的同源性，在94.0%～99.7%之間。通過軟件DNAstar分析49 ku ES蛋白的抗原性，旋毛蟲各種株之間幾乎沒有差異。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR

表2 旋毛蟲49 ku ES基因序列同源性Table 2 Homology of 49 ku ES sequence of Trichinella spp.

所測得6個旋毛蟲株與GenBank中的T.spiralis標(biāo)準(zhǔn)序列P49核苷酸序列同源性高達(dá)97.2%～99.9%，不同旋毛蟲之間該序列差異很小。應(yīng)用DNAstar軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹（見圖3），可見49 ku ES序列分成2個大的分支，旋毛形線蟲（ISS3）與標(biāo)準(zhǔn)序列P49位于同一分支，黑龍江豬、犬、貓和美國豬株似乎都與本地毛形線蟲（ISS10）的同源性更高，但是從整體來看，所有蟲株間49 ku ES基因序列差異不顯著（≤2.8%），最大的差異不超過3%。磁性脂質(zhì)體處于水相上層，密度比較小，薄膜法制備的磁性脂質(zhì)體處于水相下層，密度比較大，經(jīng)過高壓均質(zhì)的脂質(zhì)體在水相中均勻的分布（見圖1）。

圖3 6株旋毛蟲與GenBank中T.spiralis相應(yīng)序列構(gòu)建的基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 49 ku ES sequence of Trichinella spp.

3 討論與結(jié)論

旋毛蟲病是危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，該病對人類健康威脅很大，至今仍未得到有效的控制，已被列為再次出現(xiàn)的疾病[1，7]。選擇敏感性高，特異性好的診斷與免疫抗原，是旋毛蟲病防治具有重要意義。ES抗原（排泄分泌抗原）直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原[4,8]。近年來應(yīng)用DNA重組技術(shù)在體外大量表達(dá)ES抗原已成為當(dāng)前研究的熱點。

本試驗對不同來源的6株旋毛蟲編碼49 ku ES抗原基因與GenBank中T.spiralis相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析。從基因系統(tǒng)發(fā)生樹來看，分為兩個進(jìn)化分支，分別以旋毛形線蟲與本地毛形線蟲兩個國際上公認(rèn)的蟲種為代表，也是我國至今僅發(fā)現(xiàn)的兩個旋毛蟲蟲種。除本實驗室保種的旋毛形線蟲與GenBank已登錄的T.spiralis相應(yīng)序列高度同源，黑龍江豬、犬、貓和美國豬旋毛蟲均與本地毛形線蟲在同源性上更接近。傳統(tǒng)分類上認(rèn)為我國豬分離株歸屬于旋毛形線蟲，犬分離株歸屬于本地毛形線蟲[9－11]，貓分離株的分類地位尚存在爭議[9,12－13]。本試驗所測序列間雖然存在一定差異，但在整體上看，所有蟲株核苷酸和氨基酸序列的同源性分別達(dá)97.2%和94.0%以上，序列間差異很小。因此在分類學(xué)上，旋毛蟲49 ku ES基因具有相當(dāng)強的保守性，該基因不能較好地區(qū)分各旋毛蟲種。

根據(jù)49 ku ES核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列，雖然序列之間存在著差異（≤15個氨基酸），然而可識別的糖基化位點卻完全相同，應(yīng)用DNAstar軟件分析編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)的抗原性，可以看出他們的抗原表位基本相同，不同旋毛蟲49 ku ES抗原性幾乎沒有差異。Western－blot檢測結(jié)果也基本證明了這一點，本地毛形線蟲的49 ku ES重組抗原可以被小鼠T.spiralis和T.nativa陽性血清以及它們的中國地理株的小鼠血清特異性識別[14]，說明該基因編碼蛋白的抗原性很穩(wěn)定，只要獲得一個蟲株的重組49 ku ES蛋白，即可用于其他不同種株旋毛蟲病的診斷及預(yù)防。研究表明，49 ku ES蛋白僅與旋毛蟲陽性血清反應(yīng)而不與陰性血清反應(yīng)，同時亦不和其他的寄生蟲病血清反應(yīng)，具有良好的特異性[15－16]，應(yīng)用旋毛蟲49 ku ES重組蛋白建立的間接ELISA檢測方法，具有較高的特異性和敏感性[17]。

由于49 ku ES排泄分泌抗原是由蟲體食道管附近的桿狀體細(xì)胞分泌，可直接與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用，受到宿主免疫機能選擇的可能性較大，因此不同旋毛蟲種株間的個別基因突變也許是受到不同宿主免疫反應(yīng)的影響，即使是同種宿主不同個體也會存在差異。可見，雖然旋毛蟲在形態(tài)、生物化學(xué)、不同宿主的繁殖力指數(shù)甚至生殖隔離等多方面上都有很大的差異，但是仍能找到不同種株間共同的抗原成分，作為診斷和免疫的良好抗原，對旋毛蟲病的防治具有重要的意義。

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