頂空進(jìn)樣法測定更昔洛韋的殘留溶劑

江冬英，胡巧云

福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州 350002

更昔洛韋（Ganciclovir），化學(xué)名為 9-（1，3-二羥基-2-丙氧甲基）鳥嘌呤，是美國Syntex公司研發(fā)的抗病毒藥，1988年6月首次于英國上市[1]。臨床上主要用于治療免疫缺陷巨細(xì)胞病毒患者感染和輪狀病毒腸炎、嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎、皰疹性口炎、皰疹性咽峽炎、兒童病毒性腦炎、眼帶狀皰疹、小兒水痘、風(fēng)疹、毛細(xì)支氣管炎、小兒流行性腮腺炎合并腦膜炎、小兒腺病毒肺炎、兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥等。本品具有廣譜抗病毒活性，能有效抑制Ⅰ型、Ⅱ型單純皰疹病毒及水痘皰疹病毒的復(fù)制，也可抑制巨細(xì)胞病毒和皰疹病毒等的復(fù)制[2-3]。其廣闊的應(yīng)用環(huán)境，使目前市場上更昔洛韋有多種劑型：注射液、粉針劑、膠囊劑、滴眼液、眼膏、分散片、凝膠、片劑和顆粒等。更昔洛韋工業(yè)生產(chǎn)的合成、精制過程中，用到了人用藥品注冊技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會（ICH）限制的多種有機溶劑[4]，其中有二類溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF，限度0.088%）及三類溶劑乙酸乙酯（限度0.5%）[5]。目前關(guān)于乙酸乙酯和DMF殘留量的檢測，尚未見有文獻(xiàn)報道。本文按《中國藥典》2010年版與ICH相關(guān)要求，建立了頂空氣相色譜法來測定該藥中乙酸乙酯、DMF和乙醇?xì)埩袅?，旨在為制訂采用該合成路線制備的更昔洛韋原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 6890N氣相色譜儀、安捷倫7694E頂空自動進(jìn)樣裝置 （配有Agilent操作控制及積分軟件）；Mettler Toledo AG285電子天平；乙醇、乙酸乙酯和二甲基亞砜（DMSO）和DMF均為分析純；更昔洛韋原料樣品由湖北保樂制藥有限公司提供。

2.方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件

色譜柱為 HP-5 （30 m×0.25 mm，0.25 μm） 毛細(xì)管色譜柱，柱溫采用程序升溫，初始溫度為40℃，維持2 min，再以20℃/min升至200℃并維持3 min；采用氮氣作為載氣，流速為 1 ml/min，分流比為 1∶5；檢測器為氫火焰（FID）檢測器，溫度為250℃；頂空平衡溫度為70℃，平衡時間為25 min，進(jìn)樣口溫度150℃，取頂空瓶上部氣體1 ml進(jìn)樣測定。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取乙醇、乙酸乙酯、DMF適量，精密稱定，用DMSO溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含乙醇、乙酸乙酯、DMF分別為1.0、1.0、0.5 mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液5 ml置于50 ml量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取原料10 g加入二甲基亞（DMSO）溶解，搖勻，定容至100 ml量瓶中，制得100 mg/m的供試品溶液。

2.3 方法的系統(tǒng)適用性試驗

分別取對照品溶液和樣品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測定，并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白溶劑、乙醇、乙酸乙酯與DMF各色譜峰之間分離度符合要求，峰形良好；扣除本底后，出峰次序依次為乙醇（tR=4.34 min）、乙酸乙酯（tR=5.44 min）、DMF（tR=8.48 min）。對照品溶液和樣品溶液所得色譜圖，分別見圖 1、2。

圖1 對照品溶液的典型色譜圖

圖2 樣品溶液的典型色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取上述對照品儲備液 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml于10 ml量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取上述系列溶液各2 ml，置20 ml頂空瓶中，在上述色譜條件下密封進(jìn)樣，記錄色譜圖，以待測物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得到各溶劑的線性回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 不同線性范圍下的線性回歸方程

2.5 精密度試驗

精密量取對照品溶液2 ml，置20 ml頂空瓶中，共6份，在上述色譜條件下密封進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果乙醇、乙酸乙酯和 DMF峰面積的 RSD （n=6） 分別為 1.45%、2.01%和1.04%。

2.6 重現(xiàn)性試驗

取更昔洛韋樣品（批號為20100401）約100 mg，精密稱定，共6份，按“2.2.2”項下配制供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣檢測，依法分析。所得乙醇、乙酸乙酯和DMF均未檢出。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取更昔洛韋樣品（批號為20100401）100 mg，共9份，置于9個100 ml量瓶中，分別精密加入對照品儲備液0.8、1.0、1.2 ml各三份，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，制成分別相當(dāng)于對照品質(zhì)量濃度80%、100%和120%的溶液。分別取上述溶液各2 ml，在設(shè)定的色譜條件下，頂空進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積計算回收率。結(jié)果乙醇、乙酸乙酯和DMF的平均回收率（n=9）分別為99.7%、102.1%和97.3%，RSD分別為 4.78%、3.14%和4.51%。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取已測定線性關(guān)系良好的對照品溶液，在上述色譜條件下，分別于 0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，考察溶液穩(wěn)定性。 所得乙醇、乙酸乙酯和DMF各溶劑峰面積的RSD分別為1.38%、1.60%和2.02%。

2.9 最低檢測限試驗

精確配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液，逐步稀釋，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定主峰的響應(yīng)值與基線噪聲的比值約為3∶1時，乙醇、乙酸乙酯和DMF的最低檢測濃度分別為：30 ng/ml、45 ng/ml和 82 ng/ml。

2.10 樣品測定結(jié)果

取更昔洛韋樣品約100 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，依上述方法和色譜條件測定，以外標(biāo)法計算各組分含量。結(jié)果批號為20100401、20100504和20100607的3批樣品中乙醇、乙酸乙酯和DMF均未檢出。

3 討論

3.1 程序升溫的選擇

三種溶劑中，乙醇和乙酸乙酯的沸點非常接近，均在80℃以下，但DMF的沸點較高，可達(dá)150℃以上，為了在短時間內(nèi)達(dá)到有效的分離，筆者采用了上述程序升溫的條件，在200℃時保持3 min以保證溶媒DMSO全部被吹出，而不影響下一次進(jìn)樣的測定。

3.2 溶媒的選擇

根據(jù)更昔洛韋的溶解特性，同時考慮沸點與出峰時間，筆者選擇DMSO為溶媒，樣品的乙醇、乙酸乙酯和DMF得到了比較理想的分離，可以準(zhǔn)確地測定該藥中的殘留溶劑。

3.3 本方法的優(yōu)點

本研究采用頂空進(jìn)樣法測定有機殘留溶劑，與直接進(jìn)樣相比，可以避免樣品溶液對色譜柱的污染以及樣品基質(zhì)的干擾，操作簡單，不易損壞色譜柱，柱效也較高[6-7]。

綜上所述，本文所用方法的分離度、精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到《中國藥典》2005年版的相關(guān)規(guī)定，三種溶劑的檢測下限均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ICH中這三種溶劑的用量限制。因此，本實驗建立的方法可以用來控制更昔洛韋中有機溶劑的殘留量。

[1]李收,黃翠翠.更昔洛韋臨床研究進(jìn)展[J].中國社區(qū)醫(yī)師:綜合版,2009,11(18):23.

[2]秦偉玲,阮毅燕,黃章瓊.更昔洛韋、鹽酸氨溴索治療小兒毛細(xì)支氣管炎57例的療效分析[J].廣西醫(yī)學(xué),2009,31(8):1166-1167.

[3]李桂賢,吳國瓊.胸腺素、更昔洛韋治療小兒傳染性單核細(xì)胞增多癥80例的療效觀察[J].廣西醫(yī)學(xué),2008,30(11):1803-1804.

[4]高曉榮,常宏宏,魏文瓏.更昔洛韋合成路線圖解[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2010,41(3):229-231.

[5]周海鈞.藥品注冊的國際技術(shù)要求(質(zhì)量部分)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:223.

[6]李會輕,欒成章,王尊文,等.頂空氣相色譜法測定鹽酸拉貝洛爾中有機溶劑殘留量[J].中國藥事,2010,24(4):397-398.

[7]劉冬,戰(zhàn)寒秋,王茜,等.頂空氣相色譜法測定西維來司鈉中的殘留溶劑[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2010,11(3):199-201.