降纖藥治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的機(jī)制

楊 揚(yáng) 吳衛(wèi)平 田書娟 武 雷 黃德暉 (中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100850)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)炎性脫髓鞘疾病,其主要病理表現(xiàn)為廣泛的炎性脫髓鞘過(guò)程,包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失、軸索破壞、膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增生及纖維蛋白沉積等。目前,無(wú)論采用基因敲除還是藥物干預(yù)的方法,降低纖維蛋白沉積均可改善神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和臨床癥狀[1,2]。降纖治療在MS的治療中尚未見報(bào)道。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,使用基因敲除或藥物干預(yù)方法去除纖維蛋白沉積可使實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物的發(fā)病延遲、臨床癥狀改善[3-5]。

巴曲酶是一種從蛇毒中提取和純化的類凝血酶,具有降解纖維蛋白原的作用,其在血栓性疾病的治療中已被廣泛應(yīng)用。越來(lái)越多的證據(jù)表明,纖維蛋白在炎癥反應(yīng)和自身防御中也起著重要作用。1996年,日本學(xué)者在細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒誘導(dǎo)的EAE動(dòng)物模型中應(yīng)用巴曲酶后,脊髓血管周圍的纖維蛋白沉積明顯減少,血漿纖維蛋白原濃度降低。同時(shí),預(yù)防性地注射巴曲酶可明顯減輕臨床癥狀,延緩發(fā)病及降低臨床評(píng)分[6,7]。然而,巴曲酶的降纖作用在髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)誘導(dǎo)的EAE動(dòng)物模型中是否也具有治療作用仍不清楚。我們應(yīng)用MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型,觀察巴曲酶對(duì)小鼠的臨床癥狀、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失及膠質(zhì)細(xì)胞活化等改善情況,進(jìn)一步探討纖維蛋白沉積在EAE發(fā)病機(jī)制中的作用,為臨床應(yīng)用巴曲酶治療MS提供一種更有前景的新療法和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 采用清潔級(jí)10～12周齡C57BL/6雌性小鼠(由我院動(dòng)物中心提供),使用隨機(jī)表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組(8只)、EAE對(duì)照組(12只)、巴曲酶預(yù)防用藥組(8只)和治療組(8只),飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原體的清潔飼養(yǎng)室。

1.2 EAE模型的建立 以300μgMOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)溶入 200μl PBS溶液,再加入福氏佐劑(CFA)200 μl,添加10 mg/ml結(jié)核桿菌凍干粉,冰浴下充分?jǐn)嚢?0～20分鐘充分乳化,取小鼠雙側(cè)腹壁腹腔內(nèi)注射,對(duì)照組則直接將200μl PBS液與200μl CFA乳化后注射。免疫后0及48小時(shí)腹腔內(nèi)注射150μl百日咳毒素(2μg/ml)。正常對(duì)照組則直接將200μl PBS液與200μl CFA乳化后注射。免疫后隔天對(duì)小鼠稱重,我們實(shí)驗(yàn)中按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分,不發(fā)病;1分,尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙;2分,輕度后肢力弱;3分,后肢明顯力弱;4分,后肢癱瘓;5分,后肢癱瘓合并前肢力弱或?yàn)l死狀態(tài)。

1.3 組織病理學(xué)觀察 10%水合氯醛0.2 ml麻醉各組小鼠,生理鹽水心臟灌注,4%多聚甲醛(PFA)灌注,冰上快速取出小鼠腰膨大部分脊髓及小腦。一部分在PFA中固定,用于石蠟包埋,組織切片機(jī)取6μm厚度連續(xù)切片;另一部分置30%蔗糖中4℃過(guò)夜,用于冰凍包埋后冰凍切片機(jī)10μm連續(xù)切片。每組石蠟切片用于常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)、Luxol快藍(lán)(LFB)染色,快速銀染和免疫組織化學(xué)染色,冰凍切片用于免疫熒光染色,光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,并進(jìn)行量化分析:(1)炎性浸潤(rùn)評(píng)分:0分,無(wú)炎性浸潤(rùn);1分,少許炎癥細(xì)胞軟膜下浸潤(rùn);2分,血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn);3分,血管周圍套袖樣炎細(xì)胞浸潤(rùn)但未達(dá)到實(shí)質(zhì);4分,大范圍白質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)已達(dá)中心白質(zhì)的1/4～1/2;5分,廣泛炎細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)中心白質(zhì)的1/2以上。(2)脫髓鞘評(píng)分:0分,無(wú)脫髓鞘;1分,少許軟膜下纖維脫髓鞘;2分,軟膜下部分邊緣受累但未達(dá)到實(shí)質(zhì);3分,廣泛脫髓鞘超出軟膜達(dá)到實(shí)質(zhì);4分,大范圍的白質(zhì)內(nèi)脫髓鞘但不超過(guò)橫斷面的一半面積;5分,一半或一半以上橫斷面的主要白質(zhì)內(nèi)脫髓鞘。

1.4 病理圖像分析 采用Axioplan Zeiss圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400),定量分析并評(píng)分,求其平均值。對(duì)免疫組化染色進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200),據(jù)陽(yáng)性免疫反應(yīng)的圖象灰度選擇合適的灰度分割閾值,測(cè)定陽(yáng)性免疫染色強(qiáng)度及面積。免疫組化評(píng)分(IHS)方法參照文獻(xiàn)[8]結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面聯(lián)合評(píng)分(均按上限):A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)(0～1%=0、2%～10%=1、11%～ 50%=2、51%～ 80%=3、81%～100%=4),B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)(0級(jí):陰性;1級(jí):弱陽(yáng)性;2級(jí):陽(yáng)性;3級(jí):強(qiáng)陽(yáng)性),A、B兩項(xiàng)乘積即為該組織的IHS。

1.5 纖維蛋白的免疫熒光檢測(cè)及血清纖維蛋白原濃度測(cè)定 免疫后30、40、60天每組處死發(fā)病小鼠各2只,EAE對(duì)照組、預(yù)防組及治療組小鼠各取冰凍切片進(jìn)行纖維蛋白免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察并量化分析。每組剩余小鼠于免疫后60天全部處死,冰上迅速取材并提取蛋白及RNA,同時(shí)將小鼠眼靜脈取血送我院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清纖維蛋白原濃度。

1.6 采用常規(guī)的Western blot方法測(cè)定脊髓髓鞘堿性蛋白(MBP)、主要組織相容性復(fù)合物(MHC-Ⅰ)及磷酸化蛋白激酶(p-Akt)的蛋白表達(dá),熒光定量PCR方法(兩步法)測(cè)定MBP和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各項(xiàng)指標(biāo)以±s,多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行單因素完全隨機(jī)方差分析(ANOVA),量化評(píng)分后三組評(píng)分的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 降纖治療對(duì)EAE小鼠臨床過(guò)程的改善 采用MOG誘導(dǎo)的C57BL/6 EAE小鼠模型,在免疫后13天左右陸續(xù)出現(xiàn)癥狀,逐漸表現(xiàn)為尾部張力減低,雙后肢無(wú)力,行走拖拉緩慢。隔日給藥并觀察小鼠發(fā)病情況進(jìn)行臨床評(píng)分。與EAE未用藥對(duì)照組相比,降纖預(yù)防組及治療組小鼠的臨床癥狀減輕,平均臨床評(píng)分有明顯減低(P＜0.05,圖1A)。EAE對(duì)照組、預(yù)防組及治療組的平均發(fā)病時(shí)間分別為免疫后7、10、29 天,達(dá)峰時(shí)間分別為免疫后 29、29、40 天 。在免疫后第27天[平均臨床評(píng)分:EAE對(duì)照組1.0±0.12(n=12),預(yù)防組 0.20±0.09(n=8),治療組0.05±0.02(n=8)]和免疫后第35天[平均臨床評(píng)分:EAE對(duì)照組1.40±0.10(n=9),預(yù)防組0.12±0.05(n=5),治療組 0.68±0.13(n=8)],巴曲酶降纖預(yù)防組及治療組小鼠臨床評(píng)分平均值較EAE對(duì)照組有明顯降低(P＜0.05,圖1B)。

圖1 巴曲酶降纖治療降低臨床評(píng)分并減輕臨床癥狀Fig.1 Batroxobin administration ameliorated clinical score and clinical symptoms

2.2 降纖治療減輕了炎癥和脫髓鞘,但軸索損傷無(wú)顯著差別 HE染色顯示,EAE對(duì)照組小鼠脊髓內(nèi)出現(xiàn)輕至中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而預(yù)防組和治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(圖2)。經(jīng)量化分析得到炎癥評(píng)分,巴曲酶降纖預(yù)防組(1.10±0.21)及治療組(1.40±0.13)組較EAE對(duì)照組(3.20±0.15)小鼠的脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低(P＜0.05)。預(yù)防組及治療組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較EAE對(duì)照組亦有一定程度的減輕(圖3)。LFB染色顯示巴曲酶降纖預(yù)防及治療組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)脫髓鞘程度較EAE未用藥對(duì)照組明顯減輕,EAE未用藥對(duì)照組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘脫失較嚴(yán)重,而預(yù)防組和治療組髓鞘脫失均較輕微(圖4),量化評(píng)分分析表明,預(yù)防組(1.10±0.12)及治療組(1.70±0.25)脫髓鞘程度評(píng)分較對(duì)照組(3.10±0.21)明顯降低(P＜0.05)。軸索染色可見銀染結(jié)構(gòu)欠完整、著色不均勻,軸索廣泛缺失(圖5),以EAE未用藥對(duì)照組軸索損害最為嚴(yán)重(89%),巴曲酶預(yù)防組軸索損害為80%,而治療組脊髓軸索損害為75%,經(jīng)量化分析后各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 EAE對(duì)照組、巴曲酶預(yù)防組及治療組小鼠脊髓內(nèi)炎性浸潤(rùn)情況比較(HE染色)Fig.2 Comparison of inflammatory infiltration in spinal cord in EAE control,prevention and suppression groups using HE staining

圖3 各組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)炎性浸潤(rùn)情況(HE染色)Fig.3 Comparison of inflammatory infiltration in whitematter of cerebellum in each group using HE staining

空白對(duì)照組,EAE未給藥組,預(yù)防組及治療組的小鼠脊髓及小腦組織行HE染色。在EAE未給藥小鼠脊髓、小腦白質(zhì)內(nèi)及軟膜下炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn),而巴曲酶預(yù)防組及治療組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)主要集中在軟膜附近。

2.3 EAE小鼠免疫組織化學(xué)特點(diǎn)及降纖治療效果

圖4 各組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘脫失情況(LFB染色)Fig.4 Luxol fast blue(LFB)stainingdemonstrated myelin loss in the white matter of spinal cords

圖5 各組小鼠脊髓軸索染色情況Fig.5 Comparison of silver impregnaion for axon

用MBP抗體的免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記各組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)的髓鞘蛋白。在EAE未用藥組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)可見廣泛的點(diǎn)狀脫髓鞘改變,MBP陽(yáng)性表達(dá)較巴曲酶預(yù)防組和治療組少(圖6)。巴曲酶預(yù)防組及治療組的MBP的IHS較EAE對(duì)照組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在髓鞘脫失的同時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活。通過(guò)抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體的免疫組化染色標(biāo)記活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn):與EAE未用藥對(duì)照組相比,巴曲酶預(yù)防組和治療組的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,主要表現(xiàn)為小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)彌漫性GFAP陽(yáng)性表達(dá)減少(圖7)。經(jīng)免疫組化評(píng)分顯示,巴曲酶降纖預(yù)防組及治療組GFAP的IHS較EAE對(duì)照組明顯減低(P＜0.05)。MBP和GFAP免疫熒光雙標(biāo)分析顯示:與EAE對(duì)照組相比,巴曲酶預(yù)防組和治療組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)MBP(綠色)表達(dá)增高,而GFAP(紅色)表達(dá)降低(圖8)。

圖6 EAE對(duì)照組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)廣泛的點(diǎn)狀脫髓鞘改變(MBP免疫組織化學(xué)染色)Fig.6 Multifocal widespread areas of myelin damage were observed in cerebellar white matter of EAE mice by immunochemistry analysis

圖7 與EAE未用藥對(duì)照組相比,巴曲酶預(yù)防組和治療組的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(免疫組織化學(xué)染色)Fig.7 Immunostaining sections showed dramatic reduction in GFAP-positive cells in prevention and suppression group mice as compared with controls

2.4 降纖治療減少了病灶周圍纖維蛋白的沉積

圖8 MBP和GFAP免疫熒光雙標(biāo)分析(免疫熒光染色)Fig.8 MBP and GFAP assay using double-labelling immunofluorescence

經(jīng)纖維蛋白免疫熒光檢測(cè),在EAE對(duì)照組小鼠小腦白質(zhì)內(nèi)可見纖維蛋白陽(yáng)性物質(zhì)點(diǎn)片狀沉積,而巴曲酶預(yù)防組和治療組小鼠小腦切片中纖維蛋白陽(yáng)性物質(zhì)沉積明顯減少(圖9)。IHS分析顯示:預(yù)防組和治療組較EAE對(duì)照組纖維蛋白的沉積有明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。小鼠眼球靜脈血血清中纖維蛋白原濃度(g/L)在EAE組、預(yù)防組及治療組分別為3.15±0.33、2.78±0.13和2.98±0.82,預(yù)防組與治療組的血清纖維蛋白原濃度平均值有下降趨勢(shì),但與EAE組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 降纖治療對(duì)小鼠脊髓MHCⅠ、p-Akt及MBP蛋白表達(dá)的影響 在EAE對(duì)照組、巴曲酶預(yù)防組及治療組小鼠脊髓中MHC-Ⅰ類的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異;而巴曲酶預(yù)防組及治療組較EAE對(duì)照組小鼠脊髓中的p-Akt蛋白表達(dá)降低,MBP蛋白表達(dá)升高(圖 10)。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脊髓中t-PA及MBP的mRNA表達(dá) t-PA特異性擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的Tm為(76.74±0.65)℃,MBP的 Tm為(73.34±0.85)℃,β-actin的Tm 為(84.48±0.51)℃,熔解曲線分析確定PCR產(chǎn)物的特異性(圖11)。EAE對(duì)照組、巴曲酶預(yù)防組和治療組小鼠t-PA mRNA的表達(dá)(t-PA/β-actin)分別為 0.34±0.53、5.83±1.22和9.78±0.98,巴曲酶預(yù)防組與治療組t-PA mRNA的表達(dá)明顯高于EAE對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組小鼠MBPmRNA的表達(dá)(MBP/β-actin):分別為0.78±0.34(EAE對(duì)照組)、2.53±0.87(巴曲酶治療組)和4.96±1.23(巴曲酶預(yù)防組),巴曲酶預(yù)防組與治療組MBP mRNA的表達(dá)明顯高于EAE對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖10 Western blot方法檢測(cè)MHCⅠ,p-Akt及MBP蛋白表達(dá)Fig.10 MHCⅠ,p-Akt and MBPexpression were assessed by Western blot

3 討論

MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型的建立,為我們探討MS的發(fā)病機(jī)制提供了有效的研究手段。我們已利用MOG35-55片段免疫C57小鼠成功建立了慢性單時(shí)相EAE模型[9]。MS的病理改變除了脫髓鞘、軸索損傷及膠質(zhì)細(xì)胞增生外,還包括血管周圍大量的纖維蛋白沉積,學(xué)者們已在豚鼠、大鼠、小鼠等多種動(dòng)物誘發(fā)的 EAE中發(fā)現(xiàn)有纖維蛋白沉積廣泛存在[10]。在我們的研究中,使EAE小鼠模型降低纖維蛋白能夠明顯減輕小鼠的臨床癥狀及炎性脫髓鞘改變,不僅能明顯改善臨床表現(xiàn),降低臨床評(píng)分,而且能夠減輕膠質(zhì)細(xì)胞的活性。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在臨床癥狀出現(xiàn)之前EAE小鼠體內(nèi)的凝血系統(tǒng)活性增高、纖溶活性降低,提示凝血-纖溶系統(tǒng)在 EAE發(fā)病中起非常重要的作用[11,12]。已有研究證實(shí),纖維蛋白不僅在凝血纖溶系統(tǒng)中起重要作用,而且在炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)中也起重要作用[13]。纖維蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性決定了其功能多樣性,它在MS發(fā)病過(guò)程中的作用可能是多方面的,不僅參與了血腦屏障通透性的增加及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)引起的髓鞘脫失,而且通過(guò)細(xì)胞因子的調(diào)控發(fā)揮多種生物學(xué)功能。此外,MS早期炎性脫髓鞘病理過(guò)程中纖維蛋白除了通過(guò)被破壞的血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量沉積,使得激活的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞從外周循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),同時(shí)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,引起脫髓鞘和軸索損傷[14]。炎癥和凝血過(guò)程是相互聯(lián)系的,很多炎癥反應(yīng)以凝血激活和纖維蛋白沉積為特征。在炎癥發(fā)生的同時(shí)凝血酶能引起血管通透性的增加,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附于中性粒細(xì)胞,刺激單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化性,引起血腦屏障通透性增高、凝血酶活性增加、不溶性的纖維蛋白形成并沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍[15,16]。

不論是通過(guò)遺傳學(xué)還是藥理學(xué)手段降低纖維蛋白,均可不同程度減輕EAE動(dòng)物的發(fā)病。纖維蛋白源性的γ377-395多肽注入EAE小鼠體內(nèi)后可明顯減低臨床評(píng)分和炎癥反應(yīng)。藥物降纖也可以減輕臨床癥狀,改善炎癥反應(yīng),降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活性[4]。最早應(yīng)用的降纖藥物安克洛酶可以減輕腫瘤壞死因子(TNF)轉(zhuǎn)基因小鼠的炎性脫髓鞘反應(yīng),延遲疾病的發(fā)生[5]。巴曲酶具有降低纖維蛋白原和抗凝作用,誘發(fā)t-PA的釋放并增強(qiáng)t-PA的作用,并促進(jìn)纖維蛋白溶酶的生成等。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及分離病毒誘導(dǎo)的EAE模型中,巴曲酶可以明顯減輕臨床癥狀,降低臨床評(píng)分[6]。在我們的研究中首次采用MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型,連續(xù)給予巴曲酶后可使小鼠的臨床癥狀減輕,臨床評(píng)分降低,不論是預(yù)防組還是治療組與對(duì)照組相比,均有明顯的改善效果。值得注意的是,我們給予巴曲酶預(yù)防及治療降纖的同時(shí),小鼠眼球靜脈血中檢測(cè)的纖維蛋白原濃度平均值有所降低,但各組間差別無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,小鼠均未出現(xiàn)出血等副作用。

在EAE小鼠模型中,巴曲酶能有效改善發(fā)病動(dòng)物的臨床癥狀和發(fā)病過(guò)程,主要是由于抑制了纖維蛋白原的致炎特性而不是其促凝血特性[4]。在EAE早期,隨著血腦屏障的破壞,中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍纖維蛋白原沉積,作為具有多種生物活性的物質(zhì),纖維蛋白原可能通過(guò)多種途徑參與EAE的發(fā)病過(guò)程,但具體機(jī)制仍不是很清楚。目前得到廣泛認(rèn)可的是纖維蛋白原可作為小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控子參與EAE的發(fā)病過(guò)程?；|(zhì)中纖維蛋白的沉積可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子和一氧化氮(NO),促進(jìn)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,除小膠質(zhì)細(xì)胞外,還有星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞形成中樞神經(jīng)纖維髓鞘,而星形膠質(zhì)細(xì)胞參與膠質(zhì)瘢痕的形成,二者功能的變化與MS的發(fā)生有密切關(guān)系。纖維蛋白可以通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)參與炎癥反應(yīng)。我們的研究證實(shí),巴曲酶對(duì)纖維蛋白原誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的改善情況,巴曲酶預(yù)防和治療組較對(duì)照組GFAP陽(yáng)性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯減少,表明巴曲酶可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性。此外,我們得到的結(jié)果還表明,巴曲酶可導(dǎo)致其下游激活的磷酸化Akt信號(hào)通路下調(diào),從而最終減輕炎癥反應(yīng),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,5]。

我們研究發(fā)現(xiàn),清除了纖維蛋白原的小鼠MBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加,而且在RNA水平也發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原可抑制MBP的表達(dá),提示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控纖維蛋白原的沉積可能是神經(jīng)損傷后修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵因素。有學(xué)者通過(guò)對(duì)MS患者的腦脊液研究發(fā)現(xiàn),GFAP水平與患者臨床殘疾評(píng)分(EDSS)有關(guān),GFAP越高EDSS評(píng)分也越高,故它可以作為不可逆損害的標(biāo)志,但GFAP的升高沒有特異性,反應(yīng)性的膠質(zhì)增生可見于多種疾病[17]。本組實(shí)驗(yàn)中EAE未用藥組小鼠脊髓中有大量纖維蛋白沉積,刺激了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生,引起臨床癥狀的惡化,造成神經(jīng)功能的不可逆損害,而使用巴曲酶后,星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少,減緩了神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成,臨床癥狀輕且預(yù)后好,不可逆的神經(jīng)功能障礙幾率降低,故我們推測(cè)臨床使用可能會(huì)改善患者的預(yù)后。

纖維蛋白沉積的同時(shí),纖溶系統(tǒng)亦出現(xiàn)上調(diào)[18]。組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)調(diào)節(jié)的纖溶作用能夠產(chǎn)生一種“保護(hù)機(jī)制”,即隨著纖維蛋白沉積,纖溶系統(tǒng)上調(diào)增強(qiáng)纖維蛋白的溶解對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)是一種保護(hù)作用,早期的纖維蛋白增加是機(jī)體對(duì)抗炎癥與損傷的保護(hù)反應(yīng);當(dāng)病程進(jìn)展纖維蛋白大量沉積,又會(huì)加重MS病情。因此,在MS發(fā)病過(guò)程中,纖維蛋白既發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用又啟動(dòng)了炎性脫髓鞘的病理過(guò)程,引起相應(yīng)的神經(jīng)損傷。

我們目前的實(shí)驗(yàn)中,巴曲酶預(yù)防組和治療組與EAE對(duì)照組相比,小鼠脊髓和小腦的炎性脫髓鞘反應(yīng)明顯減輕,然而,纖維蛋白介導(dǎo)的炎性脫髓鞘作用機(jī)制還不是十分清楚,但至少可以通過(guò)降纖改善EAE小鼠的炎癥反應(yīng),提示我們將纖維蛋白作為一種治療靶標(biāo)有利于今后應(yīng)用于MS患者的疾病預(yù)防和治療。

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