血管性癡呆患者血漿中Tau蛋白與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系

許二赫 賈建平 (首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100053)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指各種腦血管病引起的獲得性智能損害和認(rèn)知障礙綜合征,是一種慢性進行性疾病。我國VD患病率1.1%～3.0%,目前其病因尚未完全明確。Tau蛋白是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運系統(tǒng),在微管的合成和穩(wěn)定中具有重要作用,主要在神經(jīng)元合成,有研究發(fā)現(xiàn)VD患者腦脊液Tau蛋白濃度增高,據(jù)此推測Tau蛋白在VD發(fā)病機制中可能起到作用[1]。載脂蛋白E(ApoE)是參與膽固醇代謝的重要血清脂蛋白之一,在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝尤其神經(jīng)元損傷或發(fā)育期間的生長和再生有重要功能,主要由肝臟的肝實質(zhì)細(xì)胞合成,腦組織中的星形細(xì)胞也可合成。ApoE是一種多形性蛋白,基因編碼位于第19號染色體,有6種表型:純合子E2/2、E2/3 、E4/4和雜合子 E2/3 、E2/4 、E3/4,現(xiàn)已證實ApoE的不同基因型與高血脂癥、VD有關(guān),尤其ApoEε4與VD的關(guān)系密切。我們擬用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法進行ApoE基因多態(tài)性分析,同時應(yīng)用ELISA法進行Tau蛋白定量分析,探討VD患者血漿中二者的關(guān)系,為VD患者的臨床早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象 (1)VD組:本組102例,選自2008年1月至2008年12月神經(jīng)內(nèi)科住院的患者及2009年1月至2009年5月神經(jīng)內(nèi)科門診患者,其中男65例,女37例,年齡60～72歲,平均年齡(65.8±5.8)歲。經(jīng)簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)、長谷川癡呆量表初篩做出癡呆診斷,診斷均符合美國精神病學(xué)會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊DSM-IV的血管性癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn),Hachinsk缺血量表評分(HIS)＞7分。根據(jù)MMSE量表劃分VD患者嚴(yán)重程度,分為輕度(20～24分)43例,中度(10～19分)38例,重度(10分以下)21例。根據(jù)臨床、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、頭顱 CT和(或)MRI和相關(guān)實驗室檢查,均排除其他神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)和物質(zhì)原因所致的癡呆。(2)對照組:選取健康老年人100例作為對照組,其中男58例,女42例,年齡58～75歲,平均年齡(64.2±6.7)歲。腦梗死診斷根據(jù)第四屆全國腦血管病會議制定的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組間年齡、性別等構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)差異,所有病例根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、量表檢測及頭顱CT或(和)頭顱MRI檢查,均提示有腦血管病和局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取靜脈血5 ml,置聚丙烯EDTA抗凝管中,于4℃低溫以1 000 r/min離心3分鐘,取上清于-70℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 實驗方法 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿中Tau蛋白濃度,操作嚴(yán)格按試劑盒說明書要求進行,Tau蛋白檢測試劑盒由比利時INNOTEST公司提供。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)進行ApoE基因多態(tài)性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床一般資料比較 VD組及對照組性別、年齡構(gòu)成差異無顯著性(均P＞0.05)。

2.2 VD組與對照組ApoE基因多態(tài)性分析 VD組與對照組中ε4等位基因頻率分別為31.4%和7.0%(P＜0.01,表1)。

表1 VD組與對照組ApoE基因多態(tài)性分布(%)Tab.1 ApoE gene polymorphism in VD and control groups(%)

表2 VD組與對照組血漿中Tau蛋白水平的比較Tab.2 Comparison of Tau protein level in plasma of VD and control groups

表3 攜帶ε4 VD患者與非攜帶ε4 VD患者Tau蛋白水平的比較Tab.3 Comparison of Tau protein level betweenε4 VD and non-ε4 VD patients

2.3 VD組、攜帶ε4VD組與對照組血漿中Tau蛋白水平的比較 研究發(fā)現(xiàn)VD患者血漿中Tau蛋白濃度(12.4±7.1)pg/ml高于對照組(5.2±4.1)pg/ml,攜帶ε4VD患者Tau蛋白濃度(23.3±4.3)pg/ml明顯高于對照組(5.2±4.1)pg/ml,均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,表2)。

2.4 攜帶ApoEε4等位基因的VD患者與非攜帶ApoEε4等位基因的VD患者Tau蛋白水平的比較在血漿中Tau蛋白與ApoE基因型的關(guān)系方面,攜帶ε4等位基因VD患者(23.3±4.3)pg/ml與非攜帶ε4等位基因VD患者(14.1±4.2)pg/ml和對照組(5.2±4.1)pg/ml相比Tau蛋白濃度明顯升高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,表3)。

3 討論

Tau蛋白是微管相關(guān)蛋白,與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運等多種功能有關(guān)。正常情況下人腦中的Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在,兩者處于一種平衡狀態(tài)。過度磷酸化后Tau蛋白生理功能發(fā)生了變化,不僅與正常微管相關(guān)蛋白互相競爭,影響微管形成,而且促進正常微管相關(guān)蛋白與微管的分離,使微管崩解。并形成各種沉積物在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi),引起神經(jīng)元損害。Tau的過度磷酸化被認(rèn)為在AD發(fā)病機制中起到重要作用,但其與血管性癡呆的發(fā)病是否相關(guān),目前研究較少。

1993年,Hesse[2]對卒中患者腦脊液中的Tau蛋白進行了研究,他發(fā)現(xiàn)患者腦脊液中的Tau蛋白在卒中后第2～3天開始升高達正常參考值的1.28倍,到第3周,腦脊液中的Tau蛋白量達正常參考值的3倍,持續(xù)升高直到3～5個月后才下降至正常水平,表明Tau蛋白是神經(jīng)元缺血性損傷較為敏感的標(biāo)志。Jeff victoroff等[3]對196血管性癡呆患者進行多中心臨床和病理研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VD患者中約55%的腦組織病理中可見神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑形成以神經(jīng)細(xì)胞缺失等組織學(xué)改變。Henono等[4]對部分VD患者的智能狀況進行追蹤觀察后,發(fā)現(xiàn)原來無智能減退的患者,在第一次缺血發(fā)生后癡呆發(fā)病率可增加50%,這種狀態(tài)難以用梗死灶的范圍或者部分來解釋,認(rèn)為是腦組織中AD樣的組織學(xué)變化起到了重要作用。Tau蛋白磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的調(diào)節(jié),腦中蛋白磷酸酯酶2A活性下降是導(dǎo)致Tau蛋白異常磷酸化的一個重要因素[5]。本研究發(fā)現(xiàn)VD患者血漿中Tau蛋白濃度高于對照組,結(jié)果具有顯著性差異。說明Tau蛋白過度磷酸化在血管性癡呆發(fā)病中可能起到一定作用,但機制尚不清楚。

研究表明,在神經(jīng)元凋亡早期,許多抗原決定簇表位可以看到Tau蛋白磷酸化明顯增多,并且異常磷酸化的Tau蛋白降低了和微管結(jié)合的能力[6]。但是異常磷酸化的Tau蛋白的存在短暫,在凋亡最終階段,Tau蛋白去磷酸化并且被降解。認(rèn)為Tau蛋白的過度磷酸化和神經(jīng)元凋亡是共存的,并不是相互獨立的事件。Tau蛋白異常磷酸化很可能是凋亡過程的始動因素。有研究也發(fā)現(xiàn)Tau蛋白表達在一個月最高,兩個月稍有下降,三、四個月時明顯降低,而血管性癡呆在2周到一個月時凋亡最顯著,因此,推測Tau蛋白在血管性癡呆發(fā)病中的作用可能與凋亡相關(guān),尚需要進一步的研究[7]。

載脂蛋白E(ApoE)是一種多功能蛋白質(zhì),在脂類物質(zhì)的運載及代謝方面起著重要作用。ApoE遺傳基因具有多態(tài)性,ε2、ε3、ε4 三種主要的等位基因分別編碼E2、E3、E4三種異構(gòu)體。已有許多研究一致證實,ApoEε4為AD的危險因素。近年來國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)ApoEε4可增高血TC和低密度脂蛋白水平,從而加速動脈粥樣硬化的形成,提高VD患病危險,故認(rèn)為ApoE基因多態(tài)性與VD的關(guān)系密切。Deborah等[8]檢測高齡老年人ApoE基因與癡呆或VD的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),ApoEε4多見于AD(22%)、VD(26%),而少見于無癡呆組(7%),且E4/E4和E4/E3型較E3/E3型血漿膽固醇水平要高,這一結(jié)論得到許多學(xué)者的證實。另有一些作者認(rèn)為,當(dāng)卒中與癥狀發(fā)生前的AD相遇的時候,可能會出現(xiàn)VD,在這種情況下ApoEε4的頻率可能在VD中增加[9]。在本研究中,VD組中攜帶ApoEε4等位基因比率都明顯高于正常人,與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果較為一致,低于西方國家學(xué)者的研究結(jié)果,提示ApoE基因型可能存在不同地區(qū)、不同人種間分布的差異[10]。此結(jié)果也提示基因ApoEε4可能僅僅是VD發(fā)生的危險因素之一。

有關(guān)ApoE在VD中的發(fā)病機制可能與下列因素有關(guān):(1)ApoE多態(tài)性影響血脂和脂蛋白水平,從而促進動脈粥樣硬化的形成。(2)通過刺激巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞的形成作用于脂蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白直接參與動脈粥樣硬化的形成。(3)通過影響神經(jīng)細(xì)胞損傷后神經(jīng)支配功能的恢復(fù)而引起神經(jīng)細(xì)胞功能障礙。

綜上所述,Tau蛋白、ApoE共同參與了VD的發(fā)病過程,這一點在本研究中也得到了證實,攜帶ε4VD患者血漿中Tau蛋白濃度明顯高于對照組,攜帶ε4等位基因VD患者和非攜帶ε4等位基因VD患者Tau蛋白濃度明顯高于對照組,結(jié)果具有顯著性差異。這些結(jié)果也進一步提示血漿中Tau蛋白增高,尤其攜帶ApoEε4患者的Tau蛋白的增高可以作為VD的早期診斷依據(jù)。

1 張雪玲,丁新生,程 虹 et al.血管性癡呆腦脊液中Tau蛋白及Aβ檢測[J].江蘇醫(yī)藥雜志,2003;29(5):362-363.

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3 Jeff Victorof.Multicenter clinicopathological correlation in dementia[J].Am J Psychiatry,1995;152(10):1476-1484.

4 Henono H,Durien I,Lucas C et al.Dementia in stroke[J].Neurology,1996;47:852-853.

5 Wang T Z,Grundke-Iqbal I,Iqbal K.Restoration of biological activity of Alzheimer abnormally phosphorylated tau by deposphorylation with protein Phosphatase-2A,2B and 1[J].MOL Brain Res,1996;38(2):200-208.

6 Bancher C,Lassmann H,Breitschopf H et al.Mechanismsof cell death in Alzheimer disease[J].JNeural Transm Suppl,1997;50:141-152.

7 王守春,張 昱,常 明 et al.慢性腦缺血癡呆大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究[J].中國臨床康復(fù),2003;7(23):3412-3413.

8 Deborah D B,Matin M L,Bmuar B et al.The relationship between Apolipoprotein E,dementia,and vascular illness[J].Athereschresis,1998;140(1):173-180.

9 Barba R,Martinez-Espinom S,Redriguez-Garcia E et al.Peststroke Dementia:clinical features and vascular factor[J].Stroke,2000;31(7):1494-1501.

10 Sparks D L,Martin T A,Gross D R et al.Link between heart disease,cholesterol and Alzheimer‘s disease:a review[J].Microsc Res Tech,2000;50(4):287-290.