Trim22 B細(xì)胞表位預(yù)測及多克隆抗體制備與鑒定①

孫大康 安新業(yè) 李 勐 周曉生 (濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院,濱州256603)

目前在人類已發(fā)現(xiàn)70多種Trim(Tripartite motif,三基序)家族成員,其具有重要的抗病毒作用,并參與細(xì)胞的增殖、分化、腫瘤發(fā)生、凋亡及轉(zhuǎn)錄等方面的調(diào)節(jié)[1,2]。IFN(Interferon,干擾素)可以誘導(dǎo)Trim5α、Trim6、Trim 19、Trim21、Trim22 等多種Trim 蛋白在巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的表達(dá)[3]。有意思的是,Trim22可以影響HIV-1病毒復(fù)制的多個(gè)環(huán)節(jié),抑制病毒顆粒的產(chǎn)生。HIV-1的gag基因產(chǎn)生55 kD的衣殼蛋白前體p55,p55由病毒編碼的一個(gè)蛋白酶切成四個(gè)小蛋白:MA(p17基質(zhì))、CA(p24衣殼)、NC(p9核衣殼)和p6。Trim22能與HIV的衣殼蛋白結(jié)合,抑制HIV病毒顆粒的形成[4]。在HIV感染細(xì)胞模型中過表達(dá)Trim22之后,發(fā)現(xiàn)HIV的衣殼蛋白彌散地分布于胞漿中,不能正常地定向轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜附近,從而抑制HIV的出芽過程[4]。目前雖然已有商品化的抗Trim22抗體,但抗體效價(jià)較低。同時(shí),Trim家族成員之間同源性很高,用外源性Trim22全長蛋白作為抗原免疫動(dòng)物,制備得到的抗體特異性并不理想。通過生物信息學(xué)分析,我們選取“382KSSGFAFDPSVNYSKV397”作為抗原表位,人工合成多肽與BSA偶聯(lián)后作為免疫原,制備抗Trim22多克隆抗體,這對(duì)于研究內(nèi)源性Trim22與HIV-1衣殼蛋白及其前體相互作用的分子機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293T細(xì)胞株為本室保存;健康雄性新西蘭大白兔均由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;福氏佐劑購自Sigma公司;Lipofectamine、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;DMEM購自Gibco公司;FLAG鼠源單抗、抗人actin兔源多抗購自Sigma公司;HRP標(biāo)記的二抗anti-rabbit IgG購自Southern Biotechnology Associates公司;HRP標(biāo)記的二抗anti-mouse IgG購自R&D公司;硝酸纖維素膜(NC)購自BIO-RAD公司;ECLPlus購自Thermo公司,多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Trim22合成肽的設(shè)計(jì) 由Pubmed獲取Trim22氨基酸序列(Genbank登錄號(hào):BC035582),利用lasergene7.0和Vector NTI Advance 11軟件分析,綜合各參數(shù)預(yù)測結(jié)果,確定382～397區(qū)段氨基酸作為抗原表位,合成多肽序列:KSSGFAFDPSVNYSKV。

1.2.2 Trim22合成肽與BSA的偶聯(lián) 將10 mg BSA溶于1.0 ml的pH8.0、50mmol/L的硼酸鈉鹽緩沖液中,加入5 mg的合成肽,將二者混勻。邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.15%戊二醛溶液1 ml,于室溫條件下溫和混勻2小時(shí)。加入0.25 ml的1 mol/L甘氨酸以封閉未反應(yīng)的戊二醛。4℃下在4 L的pH 8.0、50 mmol/L的硼酸鈉鹽緩沖液中透析過夜。更換硼酸鈉鹽緩沖液后繼續(xù)透析4小時(shí),儲(chǔ)存于4℃。

1.2.3 Trim22抗體的制備 取1 mg多肽-BSA交聯(lián)物溶于1 ml的PBS,與等量完全福氏佐劑充分乳化。每只兔子免疫接種1 ml乳濁液,在皮下多個(gè)位點(diǎn)接種,每個(gè)位點(diǎn)100～200μl。3周后,免疫原劑量同前,用不完全福氏佐劑充分乳化后,皮下多點(diǎn)注射。加強(qiáng)免疫共2次,間隔時(shí)間3周,經(jīng)耳緣靜脈采血測定抗體的效價(jià),符合要求時(shí),立即頸動(dòng)脈取血。分離血清后,經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法純化,分裝保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接ELISA法效價(jià)測定 用Trim22合成多肽(2 mg/L)包被 ELISA板,每孔加入 100μl,4℃過夜。用洗滌液洗3次后,加人1%gelatin室溫封閉2小時(shí)。甩干后,依次加入倍比稀釋的兔抗血清(37℃,孵育30分鐘,洗滌5次),然后加入1∶10 000的HRP-羊抗兔IgG孵育及洗滌。最后加TMB底物液顯色,終止反應(yīng)后,讀取吸光值。

1.2.5 轉(zhuǎn)染 將Trim22、Trim22缺失突變體、Trim5α、Trim6和 Trim34α的 5′-Flag-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體分別用 Lipofectamine轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,抗Flag抗體能特異性識(shí)別Flag標(biāo)簽。參照Invitrogen公司Protocol,具體操作如下:細(xì)胞在轉(zhuǎn)染20～24小時(shí)前種入24孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%,將細(xì)胞培養(yǎng)液換成Opti-MEM無血清培液(200 μl/well)。用Opti-MEM無血清培液分別稀釋上述質(zhì)粒DNA(0.4μg/well)和 Lipofectamine試劑(0.8μl/well),將兩者混合后,室溫放置30分鐘。將上述混合物加入細(xì)胞中,5小時(shí)后換為含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.6 蛋白印跡鑒定抗體特異性 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞,用冷PBS洗一次,盡量棄去殘余的PBS;用適量體積預(yù)冷1×細(xì)胞裂解液(1.0%Nonidet P40,20 mmol/:Tris-HCl,pH8.0,10%(vol/vol)甘油,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L NaF,2 mmol/L sodium orthovanadate,1 mmol/L sodium pyrophosphate and a protease inhibitor‘cocktail'Roche)。冰上放置15分鐘,充分裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液4℃11 372 r/min離心15分鐘,上清為獲取的細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后,將同等總蛋白量的不同處理樣品進(jìn)行8%～10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后,300 mA恒流轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜;轉(zhuǎn)膜完畢后,用含5%脫脂奶粉的TBS(Tris-buffered saline)在室溫下封閉1小時(shí)。然后用TBST洗滌一次,加入抗Flag抗體或抗Trim22抗體,搖床孵育1小時(shí)。用TBST洗3次,每次5分鐘。加入HRP-二抗,搖床孵育1小時(shí),用TBST洗3次,每次5分鐘。將等體積適量增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色液A液和B液混勻,覆蓋膜30秒～2分鐘,于暗室中曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 Trim22的B細(xì)胞抗原表位分析 通過進(jìn)化樹分析及氨基酸序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)在Trim家族中Trim22、Trim5、Trim6、Trim34 的同源性很高,而且均可在干擾素或LPS刺激下誘導(dǎo)性表達(dá)[3]?！癡ector NTIAdvance 11”序列比對(duì)結(jié)果顯示,上述四種蛋白在氨基端和羧基端的相似性很高,僅在(340～350)及(380～400)區(qū)段存在明顯的序列差異(圖 1A、1B)。用Lasergene軟件,參照J(rèn)ameson-Worf綜合預(yù)測方案進(jìn)行分析。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測、親水性(Hydrophilicity)、可塑性(Flexible)、抗原指數(shù)(Antigenic index)及表面可及性(Accessibility)等指標(biāo),選擇(380-400)區(qū)段中多肽序列“KSSGFAFDPSVNYSKV”,作為Trim22的B細(xì)胞抗原表位(圖1C)。

2.2 效價(jià)測定 間接ELISA法檢測表明,抗Trim22抗體的效價(jià)為1∶16 000。

2.3 對(duì)外源性Trim22的識(shí)別 把表達(dá)載體5′-FlagpcDNA3.1(+)-Trim22經(jīng)Lipofectamine轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,提取蛋白樣品進(jìn)行蛋白印跡檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染Trim22組在約55 kD處有抗Trim22抗體特異性識(shí)別的蛋白條帶;轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組對(duì)應(yīng)位置無條帶顯示(圖2)。

2.4 對(duì)內(nèi)源性Trim22的識(shí)別 干擾素刺激U937細(xì)胞后,提取蛋白樣品進(jìn)行蛋白印跡檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):干擾素刺激組在約55 kD處有抗Trim22抗體特異性識(shí)別的蛋白條帶,而未刺激組對(duì)應(yīng)位置無條帶顯示(圖3)。

2.5 對(duì)Trim22缺失突變體的識(shí)別 把5′-Flag-pcDNA3.1(+)-Trim22(1-498)及其缺失突變體Trim22(61-498)、Trim22(132-498)、Trim22(1-282)表達(dá)載體經(jīng)Lipofectamine轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,提取蛋白樣品進(jìn)行蛋白印跡檢測。由于抗 Trim22抗體是針對(duì)(382-397)區(qū)段氨基酸序列設(shè)計(jì),理論上該抗體可以識(shí)別包含該區(qū)段的Trim22缺失突變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抗Trim22抗體可以識(shí)別Trim22(1-498)、Trim22(61-498)、Trim22(132-498)缺失突變體,卻不能識(shí)別Trim22(1-282)缺失突變體(圖4)。

圖1 Trim22的B細(xì)胞抗原表位分析Fig.1 The analysis result of Trim22 antigen epitope

圖2 檢測外源性Trim22的表達(dá)Fig.2 Detection of the exogenous Trim22 expression

圖3 檢測內(nèi)源性Trim22的表達(dá)Fig.3 Detection of the endogenous Trim22 expression

圖4 抗Trim22抗體對(duì)Trim22缺失突變體的特異性識(shí)別分析Fig.4 Analysis of specificity of anti-Trim22Ab to Trim22 truncation mutant

圖5 抗Trim22抗體對(duì)Trim22旁系同源分子的識(shí)別Fig.5 Analysis of specificity of anti-Trim22Ab to Trim22 paralogous molecule

2.6 對(duì)Trim22旁系同源分子的識(shí)別 把5′-FlagpcDNA3.1(+)-Trim22及其旁系同源分子Trim5α、Trim6、Trim34α表 達(dá) 載 體 經(jīng) Lipofectamine轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞,提取蛋白樣品進(jìn)行蛋白印跡檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抗Flag抗體可以特異性識(shí)別質(zhì)粒Trim5α(494aa)、Trim6(517aa)、Trim22(498aa)、Trim34α(488)表達(dá)的蛋白;抗Trim22抗體只能識(shí)別Trim22,無法識(shí)別質(zhì)粒Trim5α、Trim6、Trim34α表達(dá)的蛋白(圖5)。

3 討論

Trim家族蛋白最顯著的特點(diǎn)是具有高度保守的RBCC結(jié)構(gòu)域。Trim蛋白結(jié)構(gòu)由三大部分組成:RING結(jié)構(gòu)域、1～2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和Coiled-coil結(jié)構(gòu)域,Trim家族也因此而得名[5]。在后生生物中,Trim家族蛋白均有表達(dá),但不同種屬之間Trim分子的種類有一定的差異。譬如,在人的基因組中有70多個(gè)成員,在小鼠中有64個(gè)成員遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蠕蟲(20左右)和果蠅(小于10),由此說明Trim家族成員隨著物種的進(jìn)化而不斷豐富[1]。

Trim22在抗HIV-1中的作用正引起人們的極大興趣,成為Trim5α之后新的研究熱點(diǎn)[6,7]。最初,人們發(fā)現(xiàn)在COS-7細(xì)胞中過表達(dá)Trim22,會(huì)抑制HIV-1長末端端重復(fù)序列相關(guān)報(bào)告基因的表達(dá)[8]。Ⅰ型、Ⅱ型IFN、LPS等均可誘導(dǎo)Trim22的表達(dá)[9]。在單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞中過表達(dá)Trim22,會(huì)抑制HIV-1的感染及復(fù)制。Trim22會(huì)導(dǎo)致感染細(xì)胞分泌的HIV-1衣殼蛋白下降,影響HIV-1生活周期晚期的病毒包裝或釋放過程[9]。最新研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比HIV-1陽性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)高表達(dá)IFN-β、MxA、Trim22,并且 Trim22 表達(dá)水平與HIV-1病毒載量呈負(fù)相關(guān),與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)[10]。體外實(shí)驗(yàn)證明,HIV-1可以誘導(dǎo)健康人PBMC表達(dá)Trim22。在Jurkat細(xì)胞中抑制Trim22表達(dá)后,HIV-1病毒顆粒的釋放及復(fù)制顯著增強(qiáng)[10]。目前,尚不清楚Trim22通過何種機(jī)制影響HIV-1生活周期晚期的病毒包裝或釋放過程[11]。另外,Trim22還可以抑制其他多種類型的病毒。Trim22通過其E3泛素連接酶活性可以抵抗腦心肌炎病毒的感染;Trim22還作用于HBV病毒核心啟動(dòng)子區(qū)域,抑制HBV的轉(zhuǎn)錄過程[12,13]。

Trim22包含氨基端的RBCC結(jié)構(gòu)域(RING、B-box、Coiled-coil)和羧基端的B30.2結(jié)構(gòu)域,大約有30多種Trim家族中成員具有這樣的組成形式。通過進(jìn)化樹及序列比對(duì)分析,我們發(fā)現(xiàn)Trim22與Trim5α、Trim6、Trim34α的同源性很高。用“Vector NTI Advance 11”進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),結(jié)果顯示:Trim22與Trim5α等在氨基端和羧基端都有很高的同源性。如果以Trim22兩端的序列設(shè)計(jì)多肽抗原,其雖然具有較好的表面可及性,但制備抗體的特異性可能受到較明顯的影響。

Trim22 與 Trim5α、Trim6、Trim34α的比對(duì)結(jié)果提示,在(380～400)區(qū)段存在明顯的序列差異。通過Lasergene軟件以“Chou Fasman”方案對(duì)Trim22的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測,在(380～400)區(qū)段無α螺旋和β片層結(jié)構(gòu),有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。以“Gamier Robson”方案對(duì)Trim22的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測,在(380～400)區(qū)段無α螺旋,有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)規(guī)則,形態(tài)固定,一般不能作為抗原表位,β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)或無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu),多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面,利于與抗體嵌合,成為抗原表位的可能性大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(380-400)區(qū)段還具有較好的親水性、可塑性、抗原指數(shù)及表面可及性,因此我們選擇“382KSSGFAFDPSVNYSKV397”合成多肽。由于多肽抗原普遍存在免疫原性較低的現(xiàn)象,通常這種激發(fā)作用比較弱,需要與載體蛋白偶聯(lián),以達(dá)到比較理想的免疫應(yīng)答水平。通常根據(jù)免疫原性、溶解性以及是否能形成較多的偶聯(lián)基團(tuán),進(jìn)行載體的選擇。多種不同種類的載體蛋白與多肽偶聯(lián)后可以作為良好的免疫原。目前最普遍使用的載體是匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和OVA(卵清白蛋白)。KLH的免疫原性最強(qiáng),可偶聯(lián)的基團(tuán)也較多,但它的溶解性較其他二者為差。本研究中采用Trim22合成肽與BSA偶聯(lián),作為抗原免疫動(dòng)物。制備的兔源性抗Trim22抗體經(jīng)純化處理后,鑒定發(fā)現(xiàn):該抗體具有良好的效價(jià),并且可以特異性識(shí)別包含該多肽序列的Trim22缺失突變體,而不能識(shí)別未包含該多肽序列的Trim22缺失突變體。同時(shí),該抗體可以特異性識(shí)別Trim22,而無法識(shí)別Trim22旁系同源分子 Trim5α、Trim6、Trim34α載體表達(dá)的蛋白。上述結(jié)果均表明該兔源性抗Trim22抗體具有很好的特異性,并且該抗體可用于免疫共沉淀,檢測與內(nèi)源性Trim22相互作用的靶蛋白(結(jié)果未顯示)。

綜上所述,通過本研究獲得了高效價(jià)的抗人Trim22多克隆抗體,該抗體可以特異性識(shí)別內(nèi)源性及外源性Trim22蛋白,為我們進(jìn)一步研究Trim22與HIV-1衣殼蛋白的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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