HIV-1 RNA被有效抑制下T細胞與外周血中HIV-1前病毒DNA相關性研究①

溫 敏 李艷萍 趙 競 方 路 馬克堅 肖小河 (云南省中醫(yī)中藥研究院,昆明650223)

過去將近20年的時間里高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy,HAART)在HIV-1感染者及艾滋病(AIDS)患者中的廣泛使用,很大程度上控制大多數(shù)感染者HIV-1病毒的復制,同時使CD4+T細胞升高,在臨床上顯著降低了AIDS[1]。但目前普遍認為抗病毒治療無法根除HIV-1,因為HIV-1病毒存儲庫的存在。研究發(fā)現(xiàn)HAART治療時間長達5年成功抑制HIV-RNA的患者外周血仍可以檢查出HIV-1前病毒DNA[2]。HIV-1前病毒DNA的下降可以成為預示長期HAART對HIV-1病毒存儲庫的作用和長期抗病毒治療有效性的指標[3-7]。目前我國HAART臨床實踐已經(jīng)取得一定進展,但尚無HIV-1 RNA被有效抑制狀態(tài)下T淋巴細胞和外周血中HIV-1前病毒DNA相關性的研究報道。本研究對云南地區(qū)90例確診為AIDS HAART持續(xù)治療時間超過6個月,血漿HIV RNA＜50個拷貝/ml的患者進行研究,考察其CD4+、CD3+、CD8+、CD4+CD28+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+和CD8+CD38+、CD38+T細胞與外周血中HIV-1前病毒DNA的相關性,了解經(jīng)過HAART治療后HIV-1 RNA被有效抑制狀態(tài)下的T細胞亞群與HIV-1前病毒DNA數(shù)量的相互關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 90例病例均來自云南騰沖,經(jīng)采用國際通用的HAART組合用藥方案治療的連續(xù)治療6個月以上,其血漿HIV RNA載量經(jīng)2次試驗測定均小于50 copies/ml的AIDS患者。90例AIDS患者的一般情況:男性54人,女性36人,年齡21～77歲,平均年齡(41±12)歲;均為性傳播途徑感染HIV-1;HAART平均治療時間6～52個月,平均持續(xù)治療時間為(25.6±13.5)個月。將90例經(jīng)過HAART治療后CD4+T細胞絕對計數(shù)根據(jù)《中國艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》分為A(CD4+＜200 cells/μ l)、B(200≤CD4+≤349 cells/μ l)、C(CD4+≥350 cells/μ l)3組,分組情況為A組31人,年齡(43±12.7)歲,HAART治療時間(24±12.5)個月,HAART治療前CD4+T細胞絕對計數(shù)(70±58.1)cells/μ l;B組13人,年齡(41±11.8)歲,HAART治療時間(26±13.7)個,HAART治療前CD4+T細胞絕對計數(shù)(78±67)cells/μ l;C 組13人,年齡(38±10.4)歲,HAART治療時間(25±12.6)個月,HAART治療前CD4+T細胞絕對計數(shù)(110±83)cells/μ l。所有感染者均簽定知情同意書,經(jīng)單位倫理委員會同意。

1.2 主要儀器與試劑 FC500流式細胞分析儀(Beckman Coulter公司);GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)(美國Beckman Coulter);單克隆熒光抗體和Optilyse C溶血素(Beckman Coulter公司);COBAS AMPLICOR自動載量儀及配套試劑盒測定病毒載量(美國Roche公司);DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit,QIAGEN,Germany);GeXP多重基因表達試劑盒(GenomeLab GeXP Start Kit);Taq酶(Thermo-Start DNA Polymerase with separate 25 mmol/L MgCl2)。

1.3 方法

1.3.1 HIV-1前病毒DNA檢測

1.3.1.1 DNA提取 使用QIAGEN公司的全血DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit,QIAGEN,Germany)按照產(chǎn)品說明書上的操作步驟提取全血DNA。

1.3.1.2 引物設計 應用GeXP Express軟件,在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/),HIV-Datebase數(shù)據(jù)庫(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)分別針對HIV-1的gag 、env、pol設計引物,由上海Invitrogen公司合成,所用引物序列見表1。

1.3.1.3 基因擴增 檢測的基因有gag、env、gagpol,以Kanr為內(nèi)參基因(1.5×104copies/ml)。逆轉(zhuǎn)錄引物終濃度為500 nmol/L,PCR引物濃度為200 nmol/L,使用 GenomeLab GeXP Start Kit(Beckman Coulter,USA)擴增,20 μ l體系中包含4 μ l 25 mmol/L MgCl2,3.5 U Thermo-Start DNA Polymerase(Thermo,USA),0.2 μ mol/L Custom PCR Primer Plex,15 ～ 50 ng DNA 模板 ,4 μ l GeXP Start Kit Buffer(Containing universal tags)。擴增(Applied Biosys 9700tem,USA)95℃10分鐘,94℃30秒,55℃30秒,68℃1分鐘,總共35個循環(huán)。對 PCR產(chǎn)物稀釋(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0 為 1∶4)。40 μ l上樣體系中包含 1 μ l PCR 反應樣品 ,0.5 μ l DNA Size Standard-400,38.5 μ l Sample Loading Solution和1滴礦物油。在Genome Lab GeXP(Beckman Coulter,USA)上檢測并做Fragment Analysis分析。

1.3.1.4 被測樣本HIV-1前病毒DNA相對拷貝數(shù)計算 數(shù)據(jù)經(jīng)GeXP多重基因表達系統(tǒng)的express軟件自動和已知產(chǎn)物分析可以得到各個PCR擴增的大小和濃度后每個被測基因PCR產(chǎn)物熒光信號和內(nèi)參基因KanrRNA比較,得到被檢測基因的相對表達值(copies/ml)和各個基因的基因表達圖譜,最后計算以HIV-1 DNA的gag、env、gag-pol 3個基因的平均值作為患者外周血的HIV-1前病毒的相對表達值。

1.3.2 T淋巴細胞亞群細胞檢測 用FC500流式細胞分析儀(Beckman Coulter公司)進行熒光抗體標記檢測。所用單克隆抗體(購自美國Beckman Coulter公司)及其組合為:CD3/CD16±CD56/CD45/CD38/CD8;CD45RA/CD45RO/CD28/CD4/CD45。加入20 μ l試劑和 100 μ l Flow-Count熒光微球至管底 ,加入100 μ l混合均勻的受試對象抗凝全血至管底,輕柔振蕩混勻后室溫避光孵育15分鐘,加入450 μ l FACS Lysing solution溶解紅細胞,室溫溶血6～12分鐘。1 700 r/min離心5分鐘,倒掉上清,用1%小牛血清洗液2ml洗滌,1 700 r/min離心5分鐘后,倒掉上清,加入 600 μ l 1%多聚甲醛固定液,上機檢測。每份樣品經(jīng)五色流式細胞儀檢測和Coulter MXP/CXP分析法對T和NK淋巴細胞進行絕對計數(shù)和相對計數(shù)測定。絕對計數(shù)是加入濃度已知的標準微球與標本一起測定,流式細胞儀控制軟件在設置后能自動計算出濃度。流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)后,由各目標群的含量,可以計算出相對含量(%)。T細胞亞群(cells/μ l)=(要計數(shù)的細胞總數(shù)/flow count微球總計數(shù))×flow count微球濃度;T細胞亞群相對計數(shù)(%)=T細胞數(shù)/淋巴細胞數(shù)。

1.3.3 HIV-1 RNA載量測定 用K3-EDTA抗凝采血管采集外周靜脈血10 ml,14小時內(nèi)分離血漿,分裝并保存于-80℃冰箱。嚴格按照病毒定量檢測儀和COBAS AMPLICORHIV-1MONITORTM 1.5版試劑盒操作說明要求進行檢測。檢測范圍50～7 500 000 copies/ml。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件,Kolmogorov-Smirnov Test作正態(tài)適配度檢驗;單因素方差分析進行組間多重比較;Spearman檢驗進行相關性分析。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 RNA被有效抑制下各組外周血T細胞亞群結(jié)果 HIV-1/AIDS患者經(jīng)過HAART持續(xù)治療HIV-1 RNA有效抑制下B、C組的CD3+T細胞絕對計數(shù)明顯高于A組(P＜0.01);C組的CD8+T細胞絕對計數(shù)高于B組的(P＜0.05);B、C組的CD4+CD28+T細胞絕對計數(shù)和相對計數(shù)明顯高于A組(P＜0.01),C組的CD4+CD28+絕對計數(shù)高于B組(P＜0.05);B、C組的 CD4+CD45RA+T細胞和CD4+CD45RO+T細胞絕對計數(shù)明顯高于A組(P＜0.01),C組的CD4+CD45RA+T細胞和CD4+CD45RO+T細胞絕對計數(shù)高于B組(P＜0.05),B、C組的CD4+CD45RO+T細胞相對計數(shù)低于A組(P＜0.05);B組、C組的CD8+CD38+T細胞絕對計數(shù)高于A組(P＜0.05),B組的CD8+CD38+T細胞相對計數(shù)低于A組(P＜0.05);C組的CD38+絕對計數(shù)高于A組(P＜0.05)。數(shù)據(jù)見表2、3。

2.2 HIV-1 RNA被有效抑制下各組外周血HIV-1前病毒DNA檢測結(jié)果 A、B、C組的HIV-1前病毒DNA的log拷貝數(shù)分別為3.561±0.297 9,3.605±0.277 6,3.434±0.289 1(copies/ml),3組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 HIV-1 RNA被有效抑制下HIV-1前病毒DNA與T細胞亞群的相關性 HIV-1前病毒DNA的log拷貝數(shù)與CD4+CD45RA+T細胞絕對計數(shù)呈負相關(P＜0.05),與CD4+CD45RA+T細胞相對計數(shù)呈明顯負相關(P＜0.01),r分別為-0.231、-0270;HIV-1前病毒DNA的log拷貝數(shù)與CD38+T細胞絕對計數(shù)呈正相關(P＜0.05),r為0.250。數(shù)據(jù)見表4、圖 1。

表1 引物序列及大小Tab.1 Primer sequences and size

表2 HIV-1 RNA被有效抑制下各組外周血T細胞亞群絕對計數(shù)結(jié)果(cells/μ l)Tab.2 Comparison of T lymphocytes absolute count in different groups with persistently undetectable plasma HIV-1 RNA(cells/μ l)

表3 HIV-1 RNA被有效抑制下各組外周血T細胞亞群相對計數(shù)結(jié)果(%)Tab.3 Comparison of T lymphocytes relative count in different groups with persistently undetectable plasma HIV-1 RNA(%)

圖1 HIV-1 RNA被有效抑制下HIV-1前病毒DNA與T細胞亞群的相關性Fig.1 Correlation between T cell and HIV-1 proviral DNA in AIDS individuals with undetectable plasma HIV-1 RNA levels

表4 HIV-1 RNA被有效抑制下HIV-1前病毒DNA與T細胞亞群的相關性結(jié)果Tab.4 Correlation between T cell and HIV-1 proviral DNAin AIDS individuals with persistently undetectable plasma HIV-1 RNA levels

2.4 HIV-1 RNA被有效抑制下HIV-1前病毒DNA與HAART持續(xù)治療時間的相關性 HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)與HAART持續(xù)治療時間做相關性分析發(fā)現(xiàn)兩者無相關性(R=0.108,P=0.310)。

3 討論

HIV感染人體后CD4+T細胞成為主要靶細胞,導致機體主要免疫病理改變——包括CD4+T細胞數(shù)量的減少,細胞功能受損和異常免疫激活等。HAART治療不僅能有效地控制HIV-1 RNA的復制,延長HIV感染進程,使AIDS患者的免疫功能得到一定程度的恢復。HIV復制被抑制是免疫重建的主要因素,因為HIV儲存庫持續(xù)存在HAART不能根除病毒,免疫系統(tǒng)不可能完全恢復。本文論述了HIV-1 RNA被有效抑制下T細胞亞群和HIV-1前病毒DNA的相關性。

HIV-1前病毒DNA以嵌合或非嵌合的形式存在于T細胞核內(nèi),一旦停藥后患者血漿中的HIV-1拷貝數(shù)又明顯增高,即產(chǎn)生潛伏性感染。這些細胞不但成為HIV的保護屏障,而且作為病毒庫在一定條件下又可產(chǎn)生大量病毒并釋放到血漿中[8,9]。一些學者認為在進行1年抗病毒治療后DNA下降[10],而一些學者則認為經(jīng)過幾年的抗病毒治療后DNA仍處于穩(wěn)定水平[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)在AIDS患者在接受HAART治療長達52個月后外周血中仍可以檢測出HIV-1前病毒DNA,并且經(jīng)過HAART治療后雖然CD4+T細胞數(shù)量得到不同程度的提高但各組之間HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)沒有差異,同時HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)與HAART持續(xù)治療時間無相關性,提示經(jīng)過長時間HAART治療HIV-1前病毒DNA可能處于穩(wěn)定狀態(tài),進一步結(jié)論需要對HAART后血漿HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)進行動態(tài)追蹤觀察。

在本次研究中我們同時監(jiān)測了HIV-1 RNA血漿拷貝數(shù)、T細胞絕對計數(shù)、T細胞相對計數(shù)。在HIV/AIDS臨床檢測中應將HIV RNA病毒載量、T細胞亞群絕對計數(shù)和相對計數(shù)三者結(jié)合起來。例如在HIV RNA病毒載量保持在檢測限的情況下即使出現(xiàn)CD4+T細胞絕對計數(shù)的較大下降,應該參考其他相關數(shù)值例如CD4+T細胞相對計數(shù)和CD4/CD8比值,這些數(shù)值通常更穩(wěn)定,更少受到影響。

CD28分子是T細胞的協(xié)同刺激信號受體,它通過與抗原提呈細胞上的B7分子結(jié)合,促進T細胞增殖發(fā)揮特定功能。在T細胞實現(xiàn)其正常免疫功能中起著重要作用,若不表達CD28分子,T細胞則不能完成其正常的免疫功能,故CD28分子的表達比例可以作為CD4+T細胞功能的間接評價指標[12]。正常人CD4+T細胞95%以上都表達CD28分子,AIDS疾病進展過程中表達比例逐漸下降。研究表明經(jīng)過HAART治療后CD4+T細胞提高至200～349和大于350(cells/μ l)的AIDS患者的CD4+CD28+T細胞的絕對、相對計數(shù)明顯高于CD4+T細胞＜200(cells/μ l)的患者(P ＜0.01),同時CD4+T細胞 ≥350組的CD4+CD28+T細胞絕對計數(shù)高于CD4+T細胞在200～349(cells/μ l)之間的患者(P＜0.01)的患者。結(jié)果提示我們AIDS患者經(jīng)過規(guī)律HAART后隨著CD4+T細胞的增加,CD4+CD28+T細胞的絕對計數(shù)和相對計數(shù)也隨之增加。同時可以推測CD28分子在CD4+T細胞上的表達和CD4+T細胞數(shù)呈正相關。

CD45RO和CD45RA是CD45分子的兩種異構(gòu)體。CD4+CD45RA+T細胞為初始 CD4+T細胞,CD4+CD45RO+T細胞為記憶CD4+T細胞。CD4+CD45RA+T細胞是未接觸過特異抗原刺激的T淋巴細胞,初始CD4+T細胞和記憶CD4+T細胞在正常人各占約50%,初始CD4+T細胞經(jīng)特異抗原刺激可變?yōu)橛洃浟馨图毎鸞13]。HIV感染進程中CD4+初始T細胞亞群和記憶細胞亞群的變化十分復雜,總的趨勢是二者均在不同程度的丟失[14]。已有研究表明HAART開始后CD4+T細胞數(shù)量的恢復過程分為兩個時相:第一個時相發(fā)生在治療開始后的前兩個月,隨著病毒載量的快速下降主要為CD45RO+T細胞群增殖,同時可以觀察到較少的CD45RA+T細胞亞群增殖。第二時相發(fā)生在治療開始2～3個月后,CD4+T細胞數(shù)量將持續(xù)1年或更長緩慢而穩(wěn)定的上升,主要是初始CD4+T細胞的增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過HAART治療HIV-1 RNA被有效抑制后CD4+T細胞提高至200～349和CD4+T細胞≥350(cells/μ l)的患者的CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+T細胞絕對計數(shù)明顯高于CD4+T細胞 ＜200(cells/μ l)的患者(P＜0.01);當CD4+T細胞≥350(cells/μ l)時CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+T細胞絕對計數(shù)高于CD4+T細胞在200～349(cells/μ l)之間的患者(P＜0.05);CD4+T細胞 在200～349之間和CD4+T細胞大于350(cells/μ l)的CD4+CD45RO+相對計數(shù)高于CD4+小于200(cells/μ l,P＜0.05)的患者。結(jié)果提示我們AIDS患者經(jīng)過規(guī)律HAART后隨著CD4+T細胞的增加,CD4+CD45RA+T細胞的絕對計數(shù)、CD4+CD45RO+T細胞的絕對計數(shù)和表達比例隨之增加。同時研究發(fā)現(xiàn)HIV-1前病毒DNA的log拷貝數(shù)與CD4+CD45RA+T細胞絕對計數(shù)和相對計數(shù)呈明顯負相關(P＜0.05,0.01),但各組之間HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)沒有差異,這提示我們HIV-1前病毒DNA拷貝數(shù)的降低可能只是CD4+CD45RA+T細胞絕對計數(shù)和相對計數(shù)增加的原因之一,可能更多與CD4+T細胞絕對數(shù)量有關。

CD38和HLA-DR是處于激活狀態(tài)的T細胞表達的標志性細胞膜表面分子。HIV感染后能誘導形成特異性細胞毒性,CD8+T細胞上的CD38和HLADR表達比例增高[16]。HIV感染后T細胞激活與病毒復制水平的升高可能是互相促進的,一方面病毒復制速率越快產(chǎn)生的病毒抗原越多,為T細胞激活提供更多的刺激信號;反過來T細胞的異常激活又為病毒復制提供更多的宿主細胞,促進病毒的復制。另一方面激活的CD8+T細胞可以破壞HIV感染的CD4+T細胞,引起CD4+T細胞計數(shù)的減少[17]。已有研究證實經(jīng)HAART有效治療的患者體內(nèi)T淋巴細胞亞群的CD38、HLA-DR表達減少[18]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞絕對計數(shù)較大的 B、C組的CD8+CD38+T細胞絕對計數(shù)高于CD4+T細胞絕對計數(shù)較小的A組(P＜0.05);C組的CD38+T細胞絕對計數(shù)高于A組(P＜0.05)。CD8+CD38+T細胞和CD38+T細胞的相對表達比例在各組間并未出現(xiàn)明顯的差異。意味著CD8+CD38+T細胞和CD38+T細胞的相對表達比例和CD4+T細胞絕對計數(shù)可能沒有正相關性。同時我們研究發(fā)現(xiàn)HIV-1前病毒DNA的log拷貝數(shù)與CD38+T細胞絕對計數(shù)呈正相關(P＜0.05),表明在HIV-1 RNA有效抑制的情況下機體免疫的異常激活與HIV-1前病毒DNA的持續(xù)表達有關,意味著只有控制HIV-1前病毒DNA的表達才能控制CD8+T細胞、CD4+T細胞等免疫細胞異?；罨AART后HIV-1 RNA被有效抑制下隨著CD4+T細胞的增加T細胞免疫激活和CD4+T細胞之間的關系有待我們深入研究。

HIV/AIDS患者在接受HAART治療后T淋巴細胞亞群在數(shù)量和功能上能得到一定程度的恢復,血漿病毒載量得到有效控制,減少了機會性感染和腫瘤的產(chǎn)生。但現(xiàn)有的HAART治療策略包括早期介入、長期使用及HAART聯(lián)合IL-2等都無法清除HIV潛伏儲存庫,在HIV感染者及AIDS患者外周血和組織器官都能檢測出 HIV-1前病毒 DNA[19]。HAART是目前抑制HIV病毒復制和感染最有效的手段,那么如何實現(xiàn)抗病毒治療的最終目的即延長病人生命,同時盡可能保持最好的健康和生活質(zhì)量,如何綜合評價HAART治療過程中病毒學、免疫學和臨床標準的成功與否都是值得從事HIV/AIDS臨床工作者和藥物研究人員進一步思索和關注的。

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