黑曲霉MAN1基因在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

張 旭，李 璐，曹雨婷，徐 欣，李 杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

β－1,4－D－甘露聚糖酶（β－1,4－D－mannan mannanohydrolase EC 3.2.1.7），又簡稱為 β－D－甘露聚糖酶或β－甘露聚糖酶，是一類能夠水解含有β－1，4－甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等）的水解內(nèi)切酶[1－3]，屬于一類能夠水解半纖維素而且具有纖維素酶活性的廣譜誘導(dǎo)酶[4]。作為一種新型工業(yè)用酶，在食品、醫(yī)藥、造紙、飼料和石油等工業(yè)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景[5]，作為一種鑒定多糖結(jié)構(gòu)的工具酶[6－7]，對(duì)糖工程、植物基因工程等基礎(chǔ)研究有重要用途。

早在20世紀(jì)初，就有分解植物甘露聚糖酶的最初報(bào)道[8]，從50年代至今研究工作已經(jīng)從產(chǎn)β－甘露聚糖酶微生物菌株的選育，產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化、酶的分離純化和理化特性，酶的作用機(jī)理，不同來源酶的特性及應(yīng)用等方面轉(zhuǎn)向酶基因的克隆、表達(dá)和活性位點(diǎn)等方面。到目前為止，已從不同來源的微生物只分離到大量不同類型和功能的甘露聚糖酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)、催化機(jī)制以及分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了細(xì)致的研究[9]。本研究以β－甘露聚糖酶生產(chǎn)菌黑曲霉為材料，克隆甘露聚糖酶基因MAN1，并進(jìn)行原核表達(dá)，以期為甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉菌株（由肇東日成酶制劑有限公司提供）；大腸桿菌E.coli DH5α、BL21，質(zhì)粒PET－32b均由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNAiso Plus、RT－PCR試劑盒、pMD18－T載體、T4DNA連接酶、Prime STAR Taq酶、限制性內(nèi)切酶、Ladder Marker（購自大連寶生物工程公司）；DNA回收試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；PDA、LB培養(yǎng)基的配制方法參照美國Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的說明書，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

引物參照NCBI上甘露聚糖酶基因序列（XM001400053）設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。為方便克隆，引物的5′端分別添加了限制性酶切位點(diǎn)Eco RⅠ和NotⅠ（加下劃線表示）。引物序列如下：

P1：5′GAATTCATGAAGCTTTCCAACGCCCT3′

P2：5′GCGGCCGCTTAAGCACTACCAATAGC AG 3′

1.2 方法

1.2.1 β－甘露聚糖酶基因cDNA的克隆

黑曲霉在加入魔芋粉的液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)RNAiso Plus提供的說明書提取黑曲霉的總RNA。以總RNA為模板，按照RT－PCR試劑盒的說明書，合成cDNA的第一條鏈，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。以cDNA為模板，用引物P1、P2進(jìn)行目的基因的PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，含有 50 ng模板 cDNA，0.2 mmol·L－1dNTP,25 pmol每種引物，5×Prime STAR Loading Buffer，2 U Prime STAR Taq酶。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)；最后，72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出約1 200 bp的DNA片段，回收目的條帶，再與pMD－18T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α得到pMD18－MAN1。獲得的陽性克隆經(jīng)酶切鑒定后送往上海生工測序。

1.2.2 原核大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

大腸桿菌表達(dá)載體pET－MAN1的構(gòu)建過程如圖1所示。以Eco RⅠ、NotⅠ雙酶切pET－32b和pMD18－MAN1載體，分別回收約5 800 bp的大片段和約1 200 bp的MAN1片段，連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，挑選陽性克隆，酶切鑒定，構(gòu)建成大腸桿菌表達(dá)載體pET－MAN1。

圖1 大腸桿菌表達(dá)載體pET-MAN1的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pET-MAN1

1.2.3 β－甘露聚糖酶的誘導(dǎo)

將轉(zhuǎn)化得到的重組菌株接于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min－1，12～16 h 后，取 1%的菌液加入LB中進(jìn)行二次活化至OD600=0.8時(shí)，加入終濃度0.1 mmol·L－1的 IPTG，20 ℃、150 r·min－1條件下培養(yǎng) 2，4 和 6 h，4 000 r·min－1離心 10 min 收集菌體，裂解，取上清和沉淀做SDS－PAGE分析。同時(shí)，做未誘導(dǎo)菌株、轉(zhuǎn)大腸桿菌空菌和轉(zhuǎn)空載體菌株的對(duì)照，分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 β－甘露聚糖酶活性的測定

將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體上清用DNS法檢測β－甘露聚糖酶活性[10]。利用比色法測定酶解后還原產(chǎn)物的生成量，表示酶的活力。誘導(dǎo)2，4和6 h的不同菌株粗酶液各0.1 mL，0.9 mL的0.5%槐豆膠溶液(pH 3.5 0.05 mol·L－1磷酸緩沖液配置）置于 70 ℃水浴反應(yīng)10 min，加入DNS顯色劑3 mL，再沸水浴15 min顯色，冷卻，用蒸餾水定容至15 mL，混勻，在550 nm下測定吸光率。

酶活單位定義：在設(shè)定的溫度及pH條件下，1 min從底物溶液中分解產(chǎn)生1 μmol還原糖（表示為還原糖當(dāng)量）所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，簡稱IU。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶基因cDNA的克隆

以黑曲霉的總RNA為模板，用β－甘露聚糖酶基因引物經(jīng)RT－PCR可擴(kuò)增出約1 200 bp的目的條帶。如圖2、3所示，其帶紋單一，特異性強(qiáng)，表現(xiàn)出與目的基因大小一致的條帶。將該片段克隆連至pMD18－T并測序。Blast比對(duì)結(jié)果表明，該序列與GenBank中編號(hào)XM001400053的序列相似性為100%，所克隆的分子即為預(yù)期的MAN1基因，編碼384個(gè)氨基酸的β－甘露聚糖酶?？寺∑蔚暮塑账嵝蛄屑熬幋a多肽序列：

圖2 甘露聚糖酶基因cDNA的克隆Fig.2 Mannanase gene cloning of cDNA

圖3 克隆片段的核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.3 Nudeotide sequence of doned fragment and its amino acid sequence

經(jīng)Eco RⅠ、NotⅠ雙酶切pET-MAN1的質(zhì)粒驗(yàn)證，得到約5 900 bp和1 200 bp的片段，如圖4所示，表明載體構(gòu)建成功。

圖4 表達(dá)載體PET-MAN1酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Characterization of expression vector PET-MAN1 with endonucleas

2.3 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及酶活性鑒定

2.3.1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將轉(zhuǎn)化E.coli.BL21獲得的pET-MAN1重組子，37℃條件下，用0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)2、4、6 h后的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在約62 ku處出現(xiàn)與預(yù)計(jì)大小一致的條帶。未誘導(dǎo)的E.coli.BL21菌和轉(zhuǎn)空載體的E.coli.BL21則沒有相應(yīng)的特異條帶，如圖5所示，證明重組蛋白表達(dá)成功。

2.3.2 表達(dá)產(chǎn)物酶活性的測定

用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組大腸桿菌，用0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)2、4、6 h，菌體經(jīng)酶解破碎后，通過DNS法測定上清液酶活。IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)重組菌株酶活達(dá)到48 IU·mL-1（見表1）。

表1 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)甘露聚糖酶活性的影響Table 1 Different induction time on the activity of mannan

2.3.3 重組甘露聚糖酶的最適溫度

用DNS法分析在pH 5，不同溫度條件下重組甘露聚糖酶活性變化，并以酶活最高為100%計(jì)算相對(duì)酶活，證明其最適溫度為55℃（見圖6）。

圖5 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.5 SDS-induced protein polyacrylamide gel electrophoresis

圖6 溫度對(duì)甘露聚糖酶酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on activity of mannanase

2.3.4 重組甘露聚糖酶的最適pH

用DNS法分析在55℃，不同pH條件下重組甘露聚糖酶活性變化，并以酶活最高為100%計(jì)算相對(duì)酶活，證明其最適最適pH為5.5（見圖7）。

圖7 pH對(duì)甘露聚糖酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on activity of mannanase

3 討論與結(jié)論

重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核和原核兩大系統(tǒng)，原核系統(tǒng)主要是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有的操作簡單、價(jià)格經(jīng)濟(jì)，遺傳背景清楚等優(yōu)勢使該系統(tǒng)成為高效表達(dá)外源蛋白最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)[11]，但是很多真核基因在原核中很難高效表達(dá)，是因?yàn)檎婧嘶虻囊恍┟艽a子對(duì)于原核來說可能是稀有密碼子，如：Arg密碼子AGA、AGG、CGG、CGA、UUA；Gly密碼子GGA；Leu密碼子CUA、TTG；Ile密碼子AUA；Ser密碼子UCA等在E.coli中很少使用[12]。本試驗(yàn)選擇大腸桿菌BL21和pET－32b表達(dá)系統(tǒng)，通過與MAN1蛋白的融合，使MAN1在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，在MAN1基因384個(gè)密碼子中，有20個(gè)稀有密碼子，其中編碼Gly（G）的有5個(gè)，編碼Val（V）的有7個(gè)，編碼 Leu（L）的有 6 個(gè)，編碼 Arg(R)和 Pro（P）的各一個(gè)，稀有密碼子的存在大大降低了蛋白質(zhì)合成的速率,使蛋白表達(dá)量降低。

在微生物中β－甘露聚糖酶的來源非常廣泛，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等都是甘露聚糖酶的主要來源，真菌來源的β－甘露聚糖酶分子質(zhì)量大多在45～55 ku，最適 pH 4.0～5.5，最適溫度 55～75 ℃，真菌來源的酶多為酸性酶。本試驗(yàn)所用黑曲霉提取的β－甘露聚糖酶的分子質(zhì)量為41 ku，最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為5.5，在溫度20～60℃、pH 5～9有較大的活性區(qū)間。本試驗(yàn)只對(duì)最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH做了研究，還可以進(jìn)一步對(duì)溫度和pH的穩(wěn)定性、底物的種類和質(zhì)量濃度、離子強(qiáng)度及金屬離子和螯合劑等做出相應(yīng)的研究。

近年來已經(jīng)在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜堿芽孢桿菌（Alkalophilic Bacillussp）、里氏木霉（Trichoderma reesei）及熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescence）等中克隆到甘露聚糖酶基因，并把這些基因分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)研究。結(jié)果表明這些基因菌可以再大腸桿菌中表達(dá)，并具有甘露聚糖酶的活性。不同菌種測定得到的酶活有很大差異，本研究以RT－PCR的方法成功獲得了來源于黑曲霉的β－甘露聚糖酶基因，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并通過測定得到此酶的最適溫度和最適pH，最高酶活可達(dá)到48 IU·mL－1使其為應(yīng)用于工業(yè)奠定了基礎(chǔ)。

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