丹參酮ⅡA對(duì)腹膜透析大鼠模型伴發(fā)腹膜纖維化的預(yù)防干預(yù)作用

張苗，蔣春明，邵秋媛，孫琤，陶娜娜

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京 210008)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎病患者的一種有效的腎臟替代療法。然而，腹膜纖維化被認(rèn)為是長(zhǎng)期PD治療后超濾失敗和退出PD的主要原因［1］。雖然腹膜纖維化發(fā)病的確切機(jī)制尚不清楚，但普遍認(rèn)為，每天持續(xù)注入生物不相容性的(peritoneal dialysis fluid，PDF)導(dǎo)致了其形態(tài)學(xué)上和功能上的改變［2］。多種生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)已被證實(shí)是參與纖維化發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵因素。TGF-β1被證明是導(dǎo)致纖維化的最重要的生長(zhǎng)因子。丹參酮ⅡA是中藥丹參的提取物，已被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病方面的治療。越來(lái)越多的證據(jù)表明，丹參酮ⅡA可抑制纖維化及炎癥［3］。本研究主要探討丹參酮ⅡA對(duì)PD大鼠模型伴發(fā)腹膜纖維化的預(yù)防干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)品和試劑

丹參酮ⅡA購(gòu)自江蘇Carefree集團(tuán)有限公司(南京，中國(guó))。丹參酮ⅡA的結(jié)構(gòu)如圖1所示。4.25%葡萄糖濃度的PDF(Dianeal-N的PD-4)由百特醫(yī)療用品有限公司(廣州，中國(guó))提供。兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體、羊抗鼠CTGF多克隆抗體、兔抗肌動(dòng)蛋白抗體和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)(Santa Cruz，加利福尼亞，美國(guó))。Pv-6001免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))。正常兔和羊血清購(gòu)自GIBCO(Great Island，紐約，美國(guó))。TRIzol試劑和莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶是從Invitrogen公司(Carlsbad，加利福尼亞州，美國(guó))購(gòu)買(mǎi)。Taq DNA聚合酶、dNTP、RNAsin、寡(dT)15 引物以及TGF-β1、CTGF 和β-actin的寡核苷酸購(gòu)自TaKaRa生物工程公司(大連，中國(guó))。重組大鼠的TGF-β1、CTGF和β-actin是從武漢EIAab科技有限公司(武漢，中國(guó))購(gòu)買(mǎi)。牛血清白蛋白購(gòu)自Amresco公司(Solon，俄亥俄州，美國(guó))。

圖1 丹參酮ⅡA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of tanshinoneⅡA

1.2 動(dòng)物

40只體重180～220 g的雄性SD大鼠，飼養(yǎng)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心(南京，中國(guó))，可自由獲得食物和水。該動(dòng)物照顧與使用委員會(huì)機(jī)構(gòu)坐落在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，具備所有動(dòng)物的核準(zhǔn)協(xié)議。本研究實(shí)驗(yàn)是遵循國(guó)家對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用機(jī)構(gòu)的健康指南進(jìn)行的。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和分組

將大鼠隨機(jī)分為4組，每組各10只。對(duì)照組每天接受生理鹽水20 ml腹腔注射;PDF組每天接受4.25%葡萄糖濃度的PDF 20 ml腹腔注射;低劑量丹參酮組(TL)及高劑量丹參酮組(TH)每天接受終濃度為50 mg·L－1及100 mg·L－1丹參酮ⅡA 的4.25%葡萄糖濃度的PDF 20 ml腹腔注射。8周后，我們?cè)谧詈笠淮巫⑸浜? h處死所有大鼠并從中獲得壁層腹膜和網(wǎng)膜以供實(shí)驗(yàn)所用。

1.4 組織學(xué)分析

用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察福爾馬林固定、石蠟包埋切片(2 μm)并做HE染色和Masson染色的壁層腹膜組織。壁層腹膜致密層厚度(sub-mesothelial compact zone，SCZ)測(cè)量用200倍原圖放大的Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)進(jìn)行圖像分析。由Honda等［4］報(bào)道的五點(diǎn)測(cè)量方法來(lái)計(jì)算平均SCZ厚度。

1.5 免疫組化

低溫恒溫器內(nèi)壁層腹膜(2 μm厚)的處理采用間接免疫酶染色法。主要使用以下抗體:(1)兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體;(2)羊抗鼠CTGF多克隆抗體。TGF-β1和CTGF的免疫組化檢測(cè)使用的是pv-6001免疫組化試劑盒，采用的圖像分析軟件為Image-Pro Plus 5.0。陰性對(duì)照是通過(guò)取代正常兔或山羊血清的主要抗體獲取。

1.6 RT-PCR

根據(jù)制造商的協(xié)議用TRIzol試劑提取100 mg網(wǎng)膜中的總RNA。用總RNA中的1 μg于37℃、50 min在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR 引物序列如下:TGF-β1(forward:5'-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3'，reverse:5'-TGGGACTGA TCCCATTGATT-3');CTGF(forward:5'-GCTAAGACCTG TGGAATGGGC-3'，reverse:5'-CTCAAAGATGTCATTG CCCCC-3');β-actin(forward:5'-CGCCAACCGCGAGAAG AT-3'，reverse:5'-CGTCACCGGAGTCCATCA-3')。循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下 最后的延伸在72℃進(jìn)行10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，TGF-β1和CTGF的含量使用Image-Pro Plus 5.0分析。β-actin作為一個(gè)正?；膬?nèi)部對(duì)照。

1.7 Western blotting 分析

將冷凍的網(wǎng)膜勻漿和提取的蛋白質(zhì)(60～100 μg)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并電聚轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。該膜和抗TGF-β1、CTGF、β-actin 抗體共同孵育 1 h。經(jīng)過(guò) 3 次Tween 20的Tris-緩沖鹽溶液(TBST)水洗后，印跡用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑孵化、水洗和生長(zhǎng)。重組TGF-β1和CTGF蛋白大鼠作為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照。每個(gè)蛋白條帶的密度進(jìn)行了量化，并與正?；摩?actin對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 壁層腹膜的組織學(xué)變化

用蘇木精 伊紅和Masson染色對(duì)壁層腹膜的形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行了評(píng)估。在8周后，PDF組的腹膜樣本相較于對(duì)照組的腹膜明顯增厚(圖2A、B)。丹參酮ⅡA明顯抑制了腹膜致密層厚度的增加(圖2C、D、E)。形態(tài)學(xué)評(píng)估揭示了劑量依賴(lài)性丹參酮ⅡA對(duì)PDF引起的腹膜增厚具有顯著的抑制作用。在PDF處理的大鼠腹膜可觀(guān)察到Masson染色的大面積藍(lán)色區(qū)域，卻未出現(xiàn)在對(duì)照組(P＜0.01，圖 3A、B)。與此相反，Masson染色的藍(lán)色區(qū)域在低劑量和高劑量丹參酮ⅡA處理的大鼠細(xì)胞外基質(zhì)較無(wú)處理的PDF組明顯降低(P＜0.01，圖3C、D、E)。高劑量的丹參酮ⅡA比低劑量的丹參酮ⅡA能更有效地降低腹膜基質(zhì)積聚(P＜0.01)。

圖2 壁層腹膜致密層(SCZ)的厚度(HE染色，×200，比例尺代表100 μm)Fig 2 Hematoxylin·eosin staining of sub-mesothelial compact zone in each group (×200)

2.2 免疫組化分析壁層腹膜中TGF-β1和CTGF的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TGF-β1和CTGF的表達(dá)提示在對(duì)照組中獲得壁層腹膜組織的一些背景染色(圖4A、5A)。與此相比，PDF組發(fā)現(xiàn)一個(gè)更強(qiáng)的陽(yáng)性染色(P＜0.01，圖4B、5B)。丹參酮ⅡA治療后壁層腹膜中 TGF-β1和 CTGF 的表達(dá)顯著降低且呈劑量依賴(lài)性(圖4C、D、F，圖5C、D、F)。

圖4 壁層腹膜中TGF-β1的表達(dá)(×400)Fig 4 Expressions of TGF-β1in parietal peritoneum in each group(×400)

2.3 TGF-β1、CTGF mRNA 和蛋白質(zhì)在大網(wǎng)膜中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，PDF組大鼠大網(wǎng)膜中TGF-β1和CTGF在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)上有顯著提高(P＜0.01，圖6A～D)。聯(lián)合低或高劑量丹參酮ⅡA治療后由PDF導(dǎo)致的TGF-β1和CTGF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減弱(P＜0.01或0.05)，而高劑量丹參酮ⅡA治療組表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。

3 討 論

腹膜纖維化是長(zhǎng)期行PD伴發(fā)的腹膜結(jié)構(gòu)性變化。纖維化程度與PD的時(shí)間相關(guān)［2］。長(zhǎng)期以來(lái)，纖維化已是腹膜功能進(jìn)行性下降和超濾失敗的主要原因。傳統(tǒng)PDF所具有的生物不相容性(如高糖、低pH、乳酸鹽緩沖堿等)是腹膜纖維化發(fā)生的主要原因。其中，TGF-β1的過(guò)度表達(dá)在腹膜纖維化中起關(guān)鍵作用，并貫穿于纖維化發(fā)生到維持的整個(gè)過(guò)程。在PD過(guò)程中，尿毒癥毒素如晚期糖基化終產(chǎn)物等通過(guò)人類(lèi)腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)表面受體刺激TGF-β1的分泌;傳統(tǒng)非生物相容性PDF中的高糖、低pH值及反復(fù)發(fā)生的腹腔內(nèi)細(xì)菌感染引起腹膜間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1。TGF-β1的過(guò)度表達(dá)和分泌促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生。同樣的，CTGF作為一個(gè)促纖維化因子，亦參與了腹膜纖維化發(fā)生的病理生理過(guò)程，且CTGF的表達(dá)與TGF-β1水平呈正相關(guān)關(guān)系。在我們的PD動(dòng)物模型中，腹膜暴露于PDF中超過(guò)8周后，我們觀(guān)察到了與長(zhǎng)期PD患者腹膜中類(lèi)似的變化，如腹膜致密層增厚與基質(zhì)積聚、TGF-β1和CTGF的表達(dá)等。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為T(mén)GF-β1是腹膜自身產(chǎn)生、并且是改變腹膜功能和結(jié)構(gòu)的主要生長(zhǎng)因子。TGF-β1是由暴露在各組分的 PDF中的HPMCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的［5］。另外，TGF-β1基因可轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)大鼠腹膜產(chǎn)生纖維化［6］。而CTGF是TGF-β1誘導(dǎo)的各種組織纖維化的主要下游因子。高糖和TGF-β1均能增加HPMCs中CTGF以及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)［7-8］。近期 Mizutani等［9］研究表明，高腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)與腹膜纖維化及間皮細(xì)胞中CTGF表達(dá)的增加有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)CTGF的敲除可減少HPMCs培養(yǎng)中由TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的基質(zhì)蛋白［10］。因此，CTGF在腹膜纖維化的進(jìn)展中也發(fā)揮了重要作用。我們的研究結(jié)果顯示，TGF-β1在PD大鼠壁層腹膜和大網(wǎng)膜中表達(dá)增加，表明了TGF-β1在因PDF引起的腹膜纖維化中起著關(guān)鍵作用。本研究也證實(shí)，CTGF在PDF治療組的大鼠壁層腹膜與大網(wǎng)膜中表達(dá)增加。從而進(jìn)一步證明，我們的實(shí)驗(yàn)不但從組織學(xué)角度，而且從發(fā)生機(jī)制上證明PD大鼠模型發(fā)生了腹膜纖維化的改變。

圖6 大網(wǎng)膜中TGF-β1，CTGF mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)Fig 6 The mRNA and protein expression of TGF-β1and CTGF in omentum

抑制腹膜間皮細(xì)胞損傷和腹膜致密層的增厚，促進(jìn)間皮細(xì)胞增生，維持緊密連接結(jié)構(gòu)完整性，拮抗PDF對(duì)腹膜組織結(jié)構(gòu)和功能的損害，可預(yù)防和延緩腹膜纖維化。常規(guī)PDF中加入添加劑可提高傳統(tǒng)PDF的生物不相容性或抑制腹膜纖維化的進(jìn)程［11-12］。Mastuo等［13］觀(guān)察了關(guān)于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)對(duì)由高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹膜纖維化的影響，指出HGF能夠挽救被高糖所抑制的腹膜間皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。他們得出結(jié)論是外源性HGF能阻止腹膜纖維化的發(fā)生。對(duì)長(zhǎng)期PD大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果亦表明，5'-磷酸吡哆醛同樣能夠顯著抑制PDF引起的腹膜增厚，降低TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白在大鼠腹腔內(nèi)的表達(dá)［14］。類(lèi)似地，在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)PDF中添加氨基胍類(lèi)也能夠阻止腹膜纖維化［15］。

近來(lái)一些研究表明，丹參酮ⅡA具有顯著的抗纖維化作用［9］。例如，丹參酮ⅡA能減輕心肌纖維化及調(diào)節(jié)腎性高血壓大鼠的膠原代謝［16］，還可防止肝腎纖維化［17］。本研究中，丹參酮ⅡA干預(yù)后減少了PD大鼠腹膜致密層的厚度、基質(zhì)在腹膜的積聚、壁層腹膜中TGF-β1和CTGF的表達(dá)及大網(wǎng)膜中TGF-β1和CTGF的表達(dá)。這些結(jié)果顯示丹參酮ⅡA能夠通過(guò)抑制腹膜自身TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平來(lái)防止PDF誘導(dǎo)的腹膜纖維化。我們的研究首次證明在傳統(tǒng)PDF中添加丹參酮ⅡA具備預(yù)防腹膜纖維化的有效作用。聯(lián)合低或高劑量丹參酮ⅡA的PDF治療組中由PDF引起的TGF-β1和CTGF在壁層腹膜和大網(wǎng)膜中的表達(dá)增加得到了明顯抑制，腹膜纖維化明顯減輕。

丹參酮ⅡA是一種二萜，它被認(rèn)為是中藥丹參的一個(gè)主要生物活性分子。丹參酮ⅡA的體內(nèi)和體外毒性試驗(yàn)已得到很好的研究［18］。從小鼠模型獲得的資料顯示，丹參酮ⅡA的半數(shù)致死量(LD50)為25.807 g·kg－1，相當(dāng)于臨床人類(lèi)口服劑量的約4 000倍。此外，研究發(fā)現(xiàn)給大鼠口服劑量為2 500 mg·kg－1的丹參提取物(400倍的人口服劑量)90 d是無(wú)毒性的［19］。體外研究數(shù)據(jù)還表明丹參酮ⅡA不抑制大鼠心肌細(xì)胞的存活能力［20］。本研究提示，在臨床上長(zhǎng)期接受PD的患者中將丹參酮ⅡA作為添加劑防止腹膜纖維化是可能的，值得進(jìn)一步探討。

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