兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的多功能分子影像探針標(biāo)記及其在腫瘤模型中的活體示蹤

王心怡，居勝紅，李聰，彭新桂

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院放射科，江蘇省分子與功能影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009;2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它們對(duì)出生后新生血管的形成及維持血管穩(wěn)定性意義重大［1-2］。近年來大量研究表明骨髓源EPCs在腫瘤新生血管形成過程中有重要作用［3-4］，雖然機(jī)制尚不明確，但是多數(shù)研究者認(rèn)為生長(zhǎng)中的腫瘤通過分泌促血管生長(zhǎng)因子使骨髓中的EPCs被動(dòng)員至外周并“歸巢”到腫瘤部位［5-6］。因此，利用EPCs的“歸巢”特性，它們可以被用作影像學(xué)探針的靶向性載體進(jìn)行腫瘤成像［7］。由于腫瘤血管形成的機(jī)制非常復(fù)雜，因此相關(guān)研究尚處于起步階段。在所有小動(dòng)物活體成像方法中，磁共振成像具有無創(chuàng)和高分辨率的特點(diǎn)，相關(guān)的臨床前的研究成果很容易被轉(zhuǎn)化進(jìn)入臨床應(yīng)用［8］，但是磁共振成像在敏感性方面不具備優(yōu)勢(shì)。光學(xué)成像的高敏感性足以檢測(cè)到發(fā)射微光的物質(zhì)，但受到成像組織自身的光吸收性和散射性影響，成像效果有時(shí)不盡如人意［9］。而將磁共振和光學(xué)成像結(jié)合的多模態(tài)成像方式可以使兩種成像手段優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在臨床前研究中潛力巨大。常用的基于氧化鐵的磁共振T2對(duì)比劑可以使信號(hào)降低，但這種低信號(hào)可能會(huì)與磁場(chǎng)不均勻性混淆。另外，由于該物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)代謝，信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間遞減［10］，而非生理性的細(xì)胞內(nèi)鐵的聚集也具有一定細(xì)胞毒性［11］。T1對(duì)比劑雖然敏感性略次于前者，卻能產(chǎn)生T1正信號(hào)，因而不易受到術(shù)后組織中偽影的干擾?；卺?Gd)的對(duì)比劑已被成功用于細(xì)胞標(biāo)記和活體細(xì)胞示蹤研究［12］。

本實(shí)驗(yàn)中用細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶(bacterial cytosine deaminase，bCD)和多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)合成探針，將磁共振對(duì)比劑Gd、近紅外熒光基團(tuán)Cy5.5及熒光染料羅丹明與bCD-PLL偶聯(lián)，構(gòu)建功能性探針共軛化合物-1用于體外標(biāo)記EPCs。波長(zhǎng)650～900 nm的近紅外(near infrared，NIR)光穿透力強(qiáng)，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)生物自發(fā)熒光弱，水和血紅蛋白的吸收系數(shù)小，因此含有近紅外染料的探針非常適合進(jìn)行分子水平小動(dòng)物活體成像。同時(shí)，共軛化合物-1中結(jié)合的羅丹明具有細(xì)胞(組織)體外熒光檢測(cè)性，從而優(yōu)化了探針的熒光成像能力。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)共軛化合物-1能夠成功標(biāo)記EPCs并且不影響細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期。將標(biāo)記的細(xì)胞移植于乳腺癌荷瘤鼠模型后，通過磁共振成像和光學(xué)成像可以成功進(jìn)行小動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞示蹤。

1 材料與方法

1.1 材料

密度梯度離心液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥有限公司)，內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(EBM-2)、Single Quots組合添加劑(Lonza，美國)，RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco，美國)，人血漿纖維連接蛋白(Chemicon，美國)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)，四氮噻唑藍(lán)(MTT，F(xiàn)luka，瑞士)，二甲基亞砜(DMSO，上海生工生物工程有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Herabus，德國)，倒置相差顯微鏡(Zeiss，德國)，紫外分光光度計(jì)(Bedkmen，美國)，凈化工作臺(tái)(吳江市生化凈化設(shè)備廠)，7.0-T MR成像設(shè)備(Bruker PharmaS-can，德國)，Maestro小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)(CRi，美國)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建共軛化合物-1 bCD蛋白提取于人工培養(yǎng)的大腸桿菌，分別將羅丹明、生物素、Gd3+-DOTA三種成分與PLL連接，然后將PLL與bCD按1∶1比例合成［13］。共軛化合物-1 中 bCD hexamer/PLL/Rhodamine/Cy5.5/Gd3+-DOTA/生物素摩爾比為 1∶1∶1∶1∶15∶3，相對(duì)分子質(zhì)量為 345 000。

1.2.2 兔外周血EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 兔外周血EPCs的培養(yǎng)、鑒定工作已由本實(shí)驗(yàn)室完成，具體參見文獻(xiàn)［14］。

1.2.3 檢測(cè)共軛化合物-1對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響 用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共軛化合物-1標(biāo)記后對(duì)細(xì)胞增殖力的影響和毒性作用。生長(zhǎng)良好的P3代EPCs以104個(gè)·孔－1接種于96孔培養(yǎng)板的72個(gè)孔中，將共軛化合物-1 按0.25、0.5、1、2、3 μmol·L－1共 5 個(gè)濃度梯度分別加入孔中，每個(gè)濃度設(shè)12個(gè)復(fù)孔，另有12孔為未標(biāo)記共軛化合物-1的空白對(duì)照組。分別于標(biāo)記后第1天和第5天檢測(cè)，各組取6孔。

檢測(cè)細(xì)胞周期，選取生長(zhǎng)良好的P3代細(xì)胞，與2 μmol·L－1濃度共軛化合物-1孵育24 h，以未標(biāo)記細(xì)胞作為陰性對(duì)照。兩組各5×105個(gè)細(xì)胞，以70%酒精于4 ℃冰箱中固定24 h，加入10 μg·ml－1RNA 酶抑制劑 5 μl，37 ℃ 孵育 30 min，加入 50 μg·ml－1碘化吡啶5 μl，4℃孵育5 min后以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)吞能力動(dòng)態(tài)研究及細(xì)胞標(biāo)記率分析 P3代細(xì)胞以2 μmol·L－1濃度的共軛化合物-1進(jìn)行孵育標(biāo)記，并在熒光顯微鏡下觀察。分別在15 min、30 min、1 h、4 h、24 h、48 h 消化，經(jīng)漂洗、離心、重懸后用0.5%的多聚甲醛4℃保存，以未標(biāo)記細(xì)胞作為空白陰性對(duì)照，1×106個(gè)細(xì)胞·組－1，24 h后流式細(xì)胞儀進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用Cell Quest 3.3(BD Bioscience)軟件采集數(shù)據(jù)并分析熒光陽性細(xì)胞率。

1.2.5 乳腺癌模型的建立及EPCs移植 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將MDA-MB-231細(xì)胞約1×106個(gè)制成懸液0.1 ml，種于3～5周齡雌性裸鼠右側(cè)腋下乳腺脂肪墊中。1周左右成瘤，瘤體直徑約0.5 cm，成瘤后即移植EPCs。共軛化合物-1 按2 μmol·L－1濃度與 EPCs共同孵育 24 h后消化細(xì)胞、離心并計(jì)數(shù)。將荷瘤鼠麻醉后消毒心前區(qū)，經(jīng)心臟穿刺向左心室注射標(biāo)記或未標(biāo)記的EPCs約2×106個(gè)。

1.2.6 活體磁共振成像 磁共振成像在7.0 T Micro-MR成像設(shè)備上完成。荷瘤鼠移植EPCs后第1、5、10天分別采集腫瘤部位T1WI及T1-map序列圖像，每組3只。掃描過程中動(dòng)物使用1%異氟烷氣體麻醉并監(jiān)測(cè)呼吸頻率。磁共振成像序列采用多層面T1加權(quán)自旋回波序列(TR msec/TE msec，600/7.5)，層厚 1 mm，256×256矩陣，掃描視野(FOV)為3 cm×3 cm。通過T1-map相測(cè)算腫瘤T1弛豫時(shí)間，采用RARE序列:TR=200、400、800、1 500、3 000、5 000 msec，TE=11 msec，翻轉(zhuǎn)角180°，層厚1 mm，選擇腫瘤最大層面采集，感興趣區(qū)為10 mm2的圓形區(qū)域。

1.2.7 近紅外光學(xué)成像 與磁共振成像時(shí)間點(diǎn)相同，小動(dòng)物活體光學(xué)成像使用Maestro活體成像系統(tǒng)，橙色光激發(fā)共軛化合物-1中的 Cy5.5，激發(fā)光波長(zhǎng)675 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)695 nm，曝光時(shí)間500 ms。圖像分析使用Maestro 2.4 software，測(cè)量腫瘤組織平均信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兔外周血EPCs的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，最初分離得到的單個(gè)核細(xì)胞表現(xiàn)為小圓形，培養(yǎng)48 h發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞貼壁。貼壁細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，培養(yǎng)至第5天可見細(xì)胞集落。生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞出現(xiàn)在培養(yǎng)10 d左右，集落中央可見典型內(nèi)皮細(xì)胞的“鋪路石樣”形態(tài)。原代細(xì)胞長(zhǎng)滿后經(jīng)過反復(fù)1∶2傳代，P3代細(xì)胞呈現(xiàn)為均一的紡錘形(圖 1A)。濃度為 2 μmol·L－1的共軛化合物-1 標(biāo)記EPCs 24 h后，通過熒光顯微鏡觀察，可見被綠光激發(fā)的羅丹明分布于胞漿內(nèi)(圖1B)，說明共軛化合物-1已被細(xì)胞吞噬。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察P3代EPCsFig 1 Cellular morphology EPCs observed with an inverted microscope

2.2 共軛化合物 對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

不同濃度的共軛化合物-1標(biāo)記EPCs后第1天和第5天分別進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示各濃度標(biāo)記組光吸收值與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，EPCs的活性均未受到明顯的影響。標(biāo)記、未標(biāo)記EPCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，處于G0/G1期細(xì)胞分別為(91.27±0.04)%和(92.01±0.06)%，二者無明顯差異(P＞0.05)，標(biāo)記共軛化合物-1對(duì)細(xì)胞周期沒有顯著影響。

2.3 細(xì)胞內(nèi)吞共軛化合物-1能力

流式細(xì)胞儀測(cè)得，經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞于 15 min、30 min、1 h、4 h、24 h、48 h 的平均熒光強(qiáng)度分別為17.98、18.58、20.64、24.27、51.96、60.14，未標(biāo)記細(xì)胞為3.47(小于10為陰性)。說明細(xì)胞對(duì)共軛化合物-1的吞噬力在孵育1h內(nèi)快速上升 經(jīng)過其后一段時(shí)間的緩慢遞增，在24～48 h間內(nèi)吞速度平穩(wěn)。

2.4 乳腺癌荷瘤鼠活體磁共振成像

共軛化合物-1標(biāo)記或未標(biāo)記的EPCs經(jīng)心臟穿刺移植后第1、5、10天分別進(jìn)行活體磁共振成像。腫瘤部位信號(hào)在移植后第1天未見明顯改變。與對(duì)照組相比，標(biāo)記的EPCs移植后第5天在腫瘤周邊區(qū)域可見點(diǎn)片狀高信號(hào)出現(xiàn)(圖2)，第10天此區(qū)域高信號(hào)消失。通過T1-map相定量測(cè)算腫瘤T1弛豫時(shí)間(圖3)，標(biāo)記組在細(xì)胞移植第5天平均T1弛豫時(shí)間明顯下降，此時(shí)標(biāo)記組與對(duì)照組腫瘤平均T1弛豫時(shí)間分別為(1 618±90)ms和(1 968±28)ms，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。細(xì)胞移植后第10天標(biāo)記組T1弛豫時(shí)間回升至對(duì)照組水平。

圖2 共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs移植后第5天磁共振成像Fig 2 MR images observed at the 5th day after Conjugate-1 labeled EPCs’transplantation

圖3 共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs移植后腫瘤T1弛豫時(shí)間的改變Fig 3 The variation of intratumoral T1relaxation time after Conjugate-1 labeled EPCs’transplantation

2.5 乳腺癌荷瘤鼠光學(xué)成像

標(biāo)記或未標(biāo)記的細(xì)胞移植后第1、5、10天分別進(jìn)行活體光學(xué)成像。第1天標(biāo)記組腫瘤部位信號(hào)與對(duì)照無明顯差別(圖4A)，第5天標(biāo)記組腫瘤區(qū)域出現(xiàn)明顯信號(hào)增強(qiáng)(圖4B)，第10天信號(hào)減退(圖4C)。測(cè)量腫瘤部位平均信號(hào)強(qiáng)度(圖5)顯示，移植后第1、5、10天標(biāo)記組腫瘤平均信號(hào)分別為(2.50±0.48)、(9.38±1.83)和(3.41 ±1.65)scaled counts·s－1，第 5 天與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。移植后第10天信號(hào)雖然明顯減弱，但與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因此，共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs在乳腺癌荷瘤鼠體內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間的分布，可以“歸巢”至腫瘤部位，從而引起腫瘤信號(hào)改變。

圖4 共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs移植后近紅外光學(xué)成像Fig 4 Near-infrared fluorescent images of tumor bearing mice after Conjugate-1 labeled EPCs’transplantation

圖5 共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs移植后腫瘤平均信號(hào)強(qiáng)度的改變Fig 5 The variation of average tumoral intensity after Conjugate-1 labeled EPCs’transplantation

3 討 論

超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒子作為磁共振T2/T2*對(duì)比劑常被用于移植干細(xì)胞的示蹤研究［15-17］，但是很多的情況下在T2/T2*加權(quán)圖像上不容易區(qū)分標(biāo)記細(xì)胞與其他的低信號(hào)區(qū)。這些低信號(hào)區(qū)可以是生理性來源的血紅蛋白，也可以是病理來源的血塊或手術(shù)(外傷后)的氣體，所以磁共振成像上的低信號(hào)成為提高細(xì)胞示蹤特異性的主要障礙。此外，這些造影劑在細(xì)胞內(nèi)代謝造成的信號(hào)遞減［10］和體內(nèi)非生理性鐵聚集引起的細(xì)胞毒性［11］也影響了它的使用。因此，取而代之的方法是使用陽性對(duì)比劑，如Gd等。Gd類復(fù)合物已被成功用于細(xì)胞標(biāo)記和活體成像，并且在T1加權(quán)相上能夠提供較好的解剖細(xì)節(jié)［18］，但缺點(diǎn)是弛豫率不如氧化鐵顆粒。

本實(shí)驗(yàn)中采用新方法設(shè)計(jì)合成的多模態(tài)成像探針具有較高T1弛豫率，在T1加權(quán)像上表現(xiàn)為正信號(hào)。共軛化合物-1在25℃、pH 7.4時(shí)通過7.0-T磁共振測(cè)量水質(zhì)子的縱向弛豫率優(yōu)于臨床使用的磁共振對(duì)比劑Gd3+-DOTA［13］，彌補(bǔ)了Gd類對(duì)比劑敏感性較低的缺陷。bCD是一種具有較高穩(wěn)定性的酶，可以用于腫瘤基因治療。PLL的生物可降解性和不規(guī)則卷曲構(gòu)象能夠促使共軛化合物向間質(zhì)組織的滲透，因此被用作對(duì)比劑的載體。以Gd3+-DOTA、羅丹明及Cy5.5修飾探針可以同時(shí)在磁共振和光學(xué)成像上動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)被標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的分布。羅丹明的優(yōu)勢(shì)是在細(xì)胞或離體組織中進(jìn)行熒光成像，而Cy5.5更適合活體內(nèi)成像。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的多功能探針具有較好生物相容性，因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。

體外實(shí)驗(yàn)中，共軛化合物-1與EPCs共同孵育24 h后，通過MTT與細(xì)胞周期檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的活性并沒有顯著性差異。雖然游離Gd對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有毒性，但是在本實(shí)驗(yàn)中使用最高濃度2 μmol·L－1的共軛化合物-1標(biāo)記細(xì)胞時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用。細(xì)胞對(duì)共軛化合物-1吞噬能力的研究也為活體細(xì)胞示蹤提供了可靠依據(jù)。在細(xì)胞活體示蹤實(shí)驗(yàn)中，通過磁共振T1加權(quán)像在標(biāo)記的細(xì)胞移植后第5天即可以發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣高信號(hào)的出現(xiàn)，但是由于Gd類復(fù)合物弛豫率的限制和磁共振成像敏感性不足，信號(hào)改變?cè)趫D像上并非十分明顯。而通過T1-map動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤部位T1弛豫時(shí)間隨移植時(shí)間的改變，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的細(xì)胞移植后第5天T1弛豫時(shí)間縮短，之后又逐漸恢復(fù)，為共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs在腫瘤模型中的“歸巢”提供了依據(jù)。與此同時(shí)，活體近紅外光學(xué)成像顯示標(biāo)記的細(xì)胞移植后第5天腫瘤部位出現(xiàn)明顯高信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著差異，為EPCs的“歸巢”提供了有力證據(jù)。隨時(shí)間推移，由于共軛化合物-1標(biāo)記的EPCs分裂增殖或?qū)Ρ葎┰隗w內(nèi)降解導(dǎo)致腫瘤信號(hào)在磁共振或光學(xué)成像上都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

光學(xué)成像敏感性強(qiáng)于磁共振，而磁共振成像在顯示解剖結(jié)構(gòu)上更具優(yōu)勢(shì)。T1加權(quán)像中的高信號(hào)出現(xiàn)在腫瘤周邊表明“歸巢”的EPCs主要分布在這一區(qū)域，該現(xiàn)象可能與此部位血管新生活躍有關(guān)［5］。本實(shí)驗(yàn)將EPCs作為多功能成像探針的靶向性載體是因?yàn)镋PCs可以參與多種血管新生過程，包括腫瘤新生血管形成。標(biāo)記共軛化合物-1的外源性EPCs進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，受到腫瘤組織分泌的諸多促血管生長(zhǎng)因子作用，能與自體骨髓源EPCs一同順濃度梯度到達(dá)腫瘤組織，分布在因子高表達(dá)區(qū)，之后參與血管新生化。雖然這一過程中許多機(jī)制尚未明確，但是通過本次的細(xì)胞示蹤和今后病理水平的深入研究，相信能有更多發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了一種新的多模態(tài)成像探針——共軛化合物-1，以EPCs作為靶細(xì)胞進(jìn)行的研究顯示其具有低毒性、較高的細(xì)胞攝取率并能產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)?；铙w磁共振和光學(xué)成像均可證實(shí)標(biāo)記共軛化合物-1的EPCs的“歸巢”現(xiàn)象，為此探針用于監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)以及觀察抗腫瘤治療療效奠定了基礎(chǔ)。

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