低氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165對(duì)人胃癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響

袁翠林，歐希龍，2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化科，江蘇南京 210009)

低氧環(huán)境可以促進(jìn)胃癌腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過誘發(fā)組織缺氧，激活缺氧誘導(dǎo)因子1a(HIF-1a)可引起許多基因的轉(zhuǎn)錄激活，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)［1］。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異絲裂原，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走及血管新生和提高血管通透性等生物活性，其中活性最強(qiáng)的是VEGF165。有研究證實(shí)，胰腺癌組織存在HIF-1a過表達(dá)和尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)高表達(dá)［2］。我們前期實(shí)驗(yàn)［3］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了VEGF165的胃癌細(xì)胞uPA、基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶2(MMP-2)的表達(dá)顯著升高。關(guān)于低氧環(huán)境下VEGF165與uPA及MMP-2在細(xì)胞中表達(dá)是否存在一定的關(guān)系目前暫無確切研究。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)轉(zhuǎn)染了VEGF165的胃癌細(xì)胞株BGC-823進(jìn)行化學(xué)性低氧誘導(dǎo)，研究在低氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染了VEGF165的胃癌細(xì)胞侵襲能力及uPA、MMP-2的表達(dá)，以求進(jìn)一步揭示胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823購自中國科學(xué)院;轉(zhuǎn)載VEGF165的復(fù)制缺陷型腺病毒重組體(Ad-VEGF165)由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院構(gòu)建并贈(zèng)送;Trizol裂解液、RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司;PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成;化學(xué)性低氧誘導(dǎo)劑氯化鈷購自Sigma公司，以三蒸水配成10 mmol·L－1的儲(chǔ)存濃度，－20℃儲(chǔ)存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含 100 U·ml－1青霉素和 100 U·ml－1鏈霉素。

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)調(diào)整培養(yǎng)液用量，使細(xì)胞懸液終濃度為1.0 ×105個(gè)·ml－1，接種至 50 ml培養(yǎng)瓶中。次日，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)約60%融合時(shí)，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為20分別加入無血清無抗生素培養(yǎng)液稀釋的Ad-VEGF165的病毒液2 ml進(jìn)行病毒感染，8 h后換RPMI-1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及低氧干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分A、B、C、D組。A組:以10%胎牛血清RPMI-1640常規(guī)培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞;B組:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的常規(guī)BGC-823細(xì)胞的培養(yǎng)液，換為含有低氧模擬劑氯化鈷100 μmol及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基;C組:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ad-VEGF165;D組:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基換為含有低氧模擬劑氯化鈷100 μmol及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2.4 Transwell小室細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn) 將人工合成的基底膜材料Matrigel膠用同樣體積的無血清培養(yǎng)液稀釋后，分別取300 μg均勻加于每個(gè)小室的膜上，十字搖晃使膠平鋪在聚碳酸脂膜上，37℃成膠30 min。小室膜的下層涂布10 mg·L－1的纖黏蛋白基底(FN)50 μl。使用前加無血清培養(yǎng)液于小室內(nèi)37℃ 放置20 min，使Matrigel重新水化。分別收集4組細(xì)胞，用2.5 g·L－1胰酶消化后，用無胎牛血清的RPMI 1640洗滌細(xì)胞3次，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×108個(gè)·L－1。將Transwell小室放入六孔板中，下室中加入1 500 μl含 100 ml·L－1胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入無胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液800 μl，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，取出濾膜，95%乙醇固定15～30 min，然后行HE染色，輕輕用棉簽擦凈小室上室面無侵襲性的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下放大200倍計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)后取均值，細(xì)胞體外侵襲力以侵入濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來判定。

1.2.5 RT-PCR半定量檢測(cè)uPA、MMP-2的表達(dá) 4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)90%以上時(shí)，按Trizol試劑盒說明提取A、B、C、D各組細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳初步評(píng)價(jià)RNA的質(zhì)量，分光光度儀測(cè)定總RNA純度。根據(jù)RNA純度將每組的RNA調(diào)至每個(gè)反應(yīng)體系中含1 μg。uPA引物上游序列為5'-TCTGT GTGTGGGACTGATGC-3'，下游序列為5'-GCCCTGAC CTGAATCACAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為324 bp;MMP-2引物上游序列為5'-CTAGACAAGGGCCACAGACC-3'，下游序列為5'-GAGGAAGCAAACCTCGAACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為230 bp;β-action上游引物5'-CAAGGTCATCCATGA CAACTTTG-3'，下游引物 5'-GTCCACCACCCTGTTGCT GTAG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度496 bp。對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

每個(gè)小室隨機(jī)抽取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D組細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于其他3組細(xì)胞(P＜0.05)，提示在低氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染VEGF165的胃癌細(xì)胞體外侵襲遷移能力增強(qiáng)(圖 1、表 1)。

圖1 低氧環(huán)境和VEGF165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲能力的影響

表1 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲能力的影響±s)

表1 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲能力的影響±s)

與A組比較，a P＜0.05;與 B組比較，b P＞0.05，c P＜0.05;與 C 組比較，d P ＜0.05

組 別 細(xì)胞數(shù)量/個(gè)A組170±12.1 B組 186.07±13.82a C組 188.21±13.50ab D組 222.41±16.01acd

2.2 uPA mRNA在實(shí)驗(yàn)各組中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果(圖 2、表 2)表明，與 A、B、C 組相比，D組中uPA的mRNA表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B、C組中的uPA的mRNA表達(dá)較A組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823表達(dá)uPA mRNA的影響

表2 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823表達(dá)uPA mRNA的影響

2.3 MMP-2 mRNA在實(shí)驗(yàn)各組中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果(圖 3、表 3)表明，與 A、B、C 組相比，D組中MMP-2的mRNA表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組、C組中的MMP-2的mRNA表達(dá)較A組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

圖3 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823表達(dá)MMP-2 mRNA的影響

表3 低氧環(huán)境和VEGF-165因子對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823表達(dá)MMP-2 mRNA的影響

3 討 論

胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是造成病人死亡的主要原因。癌轉(zhuǎn)移的基本過程為:(1)癌細(xì)胞浸潤周圍正常組織，穿入小血管或淋巴管;(2)釋放癌細(xì)胞入血管或淋巴管;(3)癌細(xì)胞在循環(huán)中運(yùn)行和存活;(4)停滯在遠(yuǎn)處器官的毛細(xì)血管床;(5)出小血管或淋巴管，形成轉(zhuǎn)移灶。而其浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制為:(1)癌細(xì)胞黏附力降低;(2)蛋白溶解酶降解;(3)癌轉(zhuǎn)移中的相關(guān)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)因子。癌侵襲的關(guān)鍵步驟就是穿入管壁和穿出管壁。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素。腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移涉及到腫瘤細(xì)胞穿過ECM屏障、血管基底膜及血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境等多個(gè)環(huán)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在正常人多種組織中不表達(dá)或少量表達(dá)，而在惡性腫瘤組織中常過量表達(dá)，并以自分泌或旁分泌作用于腫瘤細(xì)胞，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后及復(fù)發(fā)相關(guān)［4-8］。

Liotta［9］指出腫瘤細(xì)胞黏附、分泌蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和移動(dòng)是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的三個(gè)關(guān)鍵步驟。MMP家族是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類。MMP-2是此家族中的重要成員，具有強(qiáng)大降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用［10］。張巖等［11-12］研究指出，VEGF165及 MMP-2是卵巢癌發(fā)生的重要相關(guān)因子，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移具有重要作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［3，13-14］，轉(zhuǎn)染了 VEGF165的胃癌細(xì)胞，其黏附和轉(zhuǎn)移能力均較正?；蛘咿D(zhuǎn)染空載體的胃癌細(xì)胞增強(qiáng)，其表達(dá)的侵襲相關(guān)分子uPA也顯著升高。其機(jī)制可能為轉(zhuǎn)染了VEGF165的胃癌細(xì)胞上調(diào)了uPA的表達(dá)，繼而通過uPA與u-PA結(jié)合，激活MMP2-9，然后 uPA與Ⅰ型膠原結(jié)合，從而調(diào)節(jié)MMP2-9的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)需要血管提供營養(yǎng)，而血管形成過程是多因子相互調(diào)控相互影響的過程，主要為:(1)血管發(fā)生階段:通過合成NO使血管擴(kuò)張、VEGF及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1表達(dá)增強(qiáng)來增加血管通透性。(2)進(jìn)展階段:通過上調(diào)MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)、上調(diào)VEGF而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)在血管生成素(angiogenin，Ang)-2的參與下，形成結(jié)節(jié)狀血管芽。(3)形成階段:在VEGF、Ang-1和整合素的作用下，單個(gè)血管芽形成血管腔，并與臨近的血管相互吻合成血管網(wǎng)。(4)塑形和改建階段:通過血小板生長(zhǎng)因子(platelet growth factor，PGF)、Ang-1等使血管平滑肌或其他細(xì)胞遷移包繞新生血管，產(chǎn)生外基質(zhì)，從而完成血管壁結(jié)構(gòu)。HIF-1是低氧狀態(tài)下血管發(fā)生的核心調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)而直接參與血管發(fā)生的全過程，其作為上游調(diào)控基因，比VEGF、Ang-2等單純基因更有效率，因此HIF-1a在新生血管形成中的作用要比單獨(dú)VEGF的作用更為重要［15］。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1a在常氧條件下迅速降解，降低了VEGF持續(xù)高表達(dá)誘發(fā)血管瘤的危險(xiǎn)性［16-17］。Bottger等［18］對(duì)壺腹癌和胰腺癌標(biāo)本作免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中uPA表達(dá)明顯增高，但是與HIF-1a的表達(dá)程度無等級(jí)相關(guān)性。高臻等［2］在對(duì)胰腺癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織存在HIF-1a過表達(dá)和uPA高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建腺病毒載體將VEGF165轉(zhuǎn)染入人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，低氧誘導(dǎo)干預(yù)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了VEGF165的胃癌細(xì)胞在低氧干預(yù)后侵襲能力及uPA、MMP-2的表達(dá)增強(qiáng)，D組與A、B、C組比較，uPA、MMP-2表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其機(jī)制可能為低氧環(huán)境下，VEGF165與uPA及MMP-2的表達(dá)存在一定的相關(guān)性，VEGF165的高表達(dá)通過一定的信號(hào)通路促進(jìn)了uPA及MMP-2的表達(dá)。在低氧環(huán)境下，VEGF165可能通過上調(diào)uPA及MMP-2的表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。但腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前對(duì)VEGF165在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制不是十分清楚，仍需進(jìn)一步研究低氧環(huán)境下VEGF165基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及信號(hào)傳導(dǎo)通路。

［1］HOLZBACH T，NESHKOVA I，VLASKOU D，et al.Searching for the right timing of surgical delay:Angiogenesis，vascular endothelial growth factor and perfusion changes in a skin-apmodel［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2009，62:1534.

［2］高臻，柴小軍，孫洪成，等.缺氧誘導(dǎo)因子和細(xì)胞黏附分子在胰腺癌中表達(dá)及臨床意義［J］.腫瘤，2008，28(3):256-259.

［3］樂紅琴，歐希龍，杭程，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響［J］.世界華人消化雜志，2008，16(36):4036-4040.

［4］BOXER G M，TSIOMPANOU E，LEVINE T，et al.Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor and microvessel counting as prognostic indicators in nodenegative colorectal cancer［J］.Tumour Biol，2005，26(1):1-8.

［5］SUN X Y，WU Z D，LIAO X F，et al.Tumor angiogenesis and its clinical significance in pediatric malignant liver tumor［J］.World J Gastroenterol，2005，11(5):741-743.

［6］翟怡，黎莉，王新美，等.Survivin、VEGF和p53在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2009，12(2):102-105.

［7］WU T T，WANG J S，JIANN B P，et al.Expression of vascular endothelial growth factor in Taiwanese benign and malignant prostate tissues［J］.J Chin Med Assoc，2007，70(9):380-384.

［8］關(guān)云艷，歐希龍.VEGF165和VEGF165b與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2006，34(6):447-450.

［9］LIOTTA L A.Tumor invasion and metastases—role of the extracellular matrix:Rhoads Memorial Award Lecture［J］.Cancer Res，1986，46(1):1-7.

［10］NOMURA H，SATO H，SEIKI M，et al.Expression of membrane-type matrix metalloproteinase in human gastric carcinomas［J］.Cancer Res，1995，55(15):3263-3266.

［11］張巖，陳穎，魏力.VEGF165與MMP2在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2008，25(11):1968-1970.

［12］CHEN Y，ZHAO W，ZHANG Y，et al.Expression of mRNA of MMP-2 and VEGF165 genes in ovarian cancer and the relationship between them［J］.Modern Oncology，2009，17(6):1143-1151.

［13］關(guān)云艷，歐希龍，孫為豪，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞在體外生長(zhǎng)及其受體表達(dá)的影響［J］.世界華人消化雜志，2007，15(7):700-705.

［14］歐希龍，關(guān)云艷，顏芳，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制［J］.世界華人消化雜志，2008，16(3):307-310.

［15］李雯霖，張莉，張?jiān)襟P，等.氧誘導(dǎo)鼠視網(wǎng)膜病變中低氧誘導(dǎo)因子-1a和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)［J］.國際眼科雜志，2010，10(6):1056-1057.

［16］DAI Y，XU M，WANG Y，et al.HIF-1 alpha induced-VEGF overexpression in bone marrow stem cells protects cardio-myocytes against ischemia［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，42(6):1036-1044.

［17］鄒多宏，黃遠(yuǎn)亮.低氧誘導(dǎo)因子-1a的研究進(jìn)展［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，37(3):320-323.

［18］BOTTGER T C，MASCHEK H，LOBO M，et al.Prognostic value of immunohistochemical expression of beta-1 integrin in pancre-atic carcinoma［J］.Oncology，1999，56(4):308-313.