人類胚胎干細(xì)胞分化研究

劉 超，劉麗華，方圣云

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，2.臨床藥理研究所，安徽合肥 230032;3.馬里蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程和技術(shù)中心，Baltimore，MD 21201 USA)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)具有自我更新(self-renewal)和多能性(pluripotent)的特點(diǎn)。人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，HESC)研究既有助于對(duì)人類疾病和發(fā)育生物學(xué)的理解，也在再生醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)中有著廣泛的應(yīng)用前景［1－2］。HESC分化成人體任何一種細(xì)胞的能力為人類發(fā)育研究和重大疾病替代治療提供了取之不盡的細(xì)胞來源。首先，來源于HESC的神經(jīng)祖細(xì)胞為人類神經(jīng)形成研究，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究和帕金森病以及脊髓損傷等疾病的細(xì)胞替代治療帶來巨大希望。但是目前常用的HESC神經(jīng)系分化方法仍然存在較多不足，例如形成 embryoid bodies(EBs)中間體的方法存在非神經(jīng)細(xì)胞系的污染，限制了神經(jīng)系分化的效率和特異性;使用基質(zhì)細(xì)胞(PA6或MS5)共培養(yǎng)方法和使用Matrigel，存在動(dòng)物類材料和病原體的污染［3］。因此，發(fā)展可控條件下的無EB中間體形成、無滋養(yǎng)層細(xì)胞、無動(dòng)物成分的高效HESC培養(yǎng)和神經(jīng)分化方法成為再生醫(yī)學(xué)研究中亟待解決的問題。其次，HESC的分化特性，使其成為一種發(fā)育研究的細(xì)胞來源，為發(fā)育生物學(xué)研究提供良好的研究平臺(tái)。為此，我們?cè)跓o滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上，建立一種使用無動(dòng)物成分細(xì)胞基質(zhì)和化學(xué)成分已知培養(yǎng)液誘導(dǎo)HESC神經(jīng)系分化方法;我們還研究視黃酸誘導(dǎo)H9細(xì)胞分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP表達(dá)的變化，探索H9細(xì)胞分化在發(fā)育研究中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1H9細(xì)胞HESC，H9 細(xì)胞系(P23 ～)，購自美國國家干細(xì)胞銀行(WiCell，Madison，WI)。

1.1.2試劑mTeSRTM1購自加拿大 Stem Cell公司。Matrigel購自美國BD Bioscience公司。視黃酸(All-trans retinoic acid，RA)、二甲亞砜(DMSO)、human insulin、progesterone、putrescin、human fibronectin、sodium selenite、human holotransferrin、recombinant人Ⅳ型膠原、polyornithine和human laminin購自美國Sigma公司。Pierce ECL免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。bFGF購自美國Cell Signaling公司。B27 supplement購自美國Invitrogen公司。Human Vitronectin購自美國 Promega公司。DMEM:F-12購自美國Cellgro公司。

1.1.3抗體anti-Oct4和 anti-BIP抗體購自 Cell Signaling，anti-β-actin抗體購自 Sigma，anti-Map2 和anti-Tuj1抗體購自Chemicon。

1.2 方法

1.2.1H9細(xì)胞培養(yǎng)參考公司手冊(cè)和文獻(xiàn)方法［4］，H9細(xì)胞培養(yǎng)在Matrigel包被的培養(yǎng)板內(nèi)，給以mTeSRTM1培養(yǎng)液。每天換液1次，細(xì)胞生長4～6 d后，除去分化的細(xì)胞，按1∶6的比例進(jìn)行傳代。1.2.2神經(jīng)分化參考文獻(xiàn)方法［5］，選擇有穹頂樣隆起結(jié)構(gòu)的H9細(xì)胞群，行機(jī)械分離轉(zhuǎn)移到人源基質(zhì)(10 mg·cm－2Ⅳ型膠原、0.2 mg·cm－2vitronectin和5 mg·cm－2fibronectin)包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，給予mTeSRTM1培養(yǎng)液。1周后將形成的花樣結(jié)構(gòu)(rosette-like structure)轉(zhuǎn)移到新包被的培養(yǎng)皿內(nèi)或玻片上，給與神經(jīng)分化培養(yǎng)液(DMEM:F-12，B27 supplement，25 g·L－1human insulin，6.3 mg·L－1progesterone，10 g·L－1putrescin，50 μg·L－1sodium selenite，50 g·L－1human holotransferrin 和8 μg·L－1human recombinant bFGF)。培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到polyornithine和laminin包被的培養(yǎng)皿內(nèi)或玻片上，用神經(jīng)分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4周或4周以上。

1.2.3視黃酸誘導(dǎo)分化用含有10 μmol·L－1RA的mTeSRTM1處理細(xì)胞，每天換液1次，持續(xù)5 d。d 6將H9細(xì)胞收獲裂解，裂解液經(jīng)免疫印記(immunoblot，IB)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.2.4免疫熒光檢測分化和未分化的H9細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定，1×PBS清洗6遍，室溫下用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS封閉60 min，一抗同樣用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS稀釋，室溫下和細(xì)胞孵育2 h后，用抗兔或抗鼠的Alexa Flour-488以及Alexa Flour-594抗體室溫孵育2 h，或用結(jié)合有FITC的雞熒光第二抗體孵育2 h。封片晾干后，置于 Zeiss Axiovert 200M倒置熒光顯微鏡下觀察成像。

1.2.5免疫印記參考文獻(xiàn)方法［6］，將細(xì)胞裂解獲得裂解液，BCA法測定蛋白濃度。吸取等量樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)上。分離后的蛋白成分分別和相應(yīng)抗體孵育后，用ECL免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。蛋白表達(dá)的定量用photoshop軟件處理。

2 結(jié)果

2.1H9細(xì)胞的特征蛋白Oct4表達(dá)未分化的H9細(xì)胞在無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長良好，其核內(nèi)表達(dá)特征性蛋白Oct4(Fig 1A，B)，分化后的細(xì)胞核內(nèi)Oct4的表達(dá)基本消失(Fig 1C，D)。

2.2神經(jīng)前體細(xì)胞分化H9細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)分化培養(yǎng)液處理后，分化7 d的H9衍生細(xì)胞90%表達(dá)有神經(jīng)前體細(xì)胞特征性蛋白Nestin(Fig 2A，D，arrows)，一定數(shù)量的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特征蛋白Tuj1(Fig 2B，D，arrow heads)。

2.3神經(jīng)細(xì)胞分化分化21 d的H9衍生細(xì)胞形成神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)(Fig 3 A，C，arrows)，且該類結(jié)構(gòu)周圍存在大量Tuj1陽性細(xì)胞(Fig 3B，D)。提示神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)的形成可能促進(jìn)H9細(xì)胞神經(jīng)分化。分化46 d的H9衍生細(xì)胞同時(shí)表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特征蛋白Map2(Fig 3E)和Tuj1(Fig 3F)。

2.4RA誘導(dǎo)分化的H9細(xì)胞內(nèi)BIP蛋白表達(dá)的變化H9細(xì)胞經(jīng)RA處理5d，Oct4蛋白的表達(dá)隨分化逐漸下調(diào)，5 d后其表達(dá)已幾乎消失(Fig 4A);而BIP蛋白的表達(dá)隨分化逐漸上調(diào)(Fig 4A，B)。提示BIP可能參與RA誘導(dǎo)的H9細(xì)胞分化。

Fig 1 Expression of Oct4 in H9 and H9 derived cells

Fig 2 Neural progenitor cells derived from H9 cells

3 討論

ESC是高度未分化的細(xì)胞，具備體外無限增殖和誘導(dǎo)分化成三個(gè)胚層細(xì)胞的特性。HESC為再生醫(yī)學(xué)提供了取之不盡的功能性細(xì)胞來源，為疾病研究提供新型的細(xì)胞模型的同時(shí)也為藥物藥效學(xué)和毒理學(xué)的研究提供了良好的平臺(tái)［7－9］。

本研究采用人源基質(zhì)和化學(xué)成分特定的神經(jīng)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)神經(jīng)分化。人源基質(zhì)材料包括Ⅳ型膠原、vitronectin和 fibronectin。其中一定濃度的vitronectin及其衍生肽已經(jīng)被最新文獻(xiàn)報(bào)道可用于胚胎干細(xì)胞的長時(shí)間培養(yǎng)［10－11］。我們所用神經(jīng)分化培養(yǎng)液的主要化學(xué)成分包括B27 supplement，N2 supplement(主要含 human insulin，progesterone，putrescin，sodium selenite，human holotransferrin)和bFGF。上述成分已經(jīng)被廣泛用于胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化研究［3］。我們誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)機(jī)械分離后可獲得90%以上的Nestin陽性細(xì)胞，形成的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)富含Tuj1陽性神經(jīng)元。這類衍生的神經(jīng)細(xì)胞將是神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞替代療法的潛在細(xì)胞來源，還可以用作篩選神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)藥物的平臺(tái)。

BIP是一主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜信號(hào)活化的調(diào)控，參與多種生理和病理過程［12］。最近的研究發(fā)現(xiàn)［13］，純合子BIP敲除導(dǎo)致小鼠死亡，伴隨胚胎細(xì)胞分化能力顯著降低和內(nèi)細(xì)胞層嚴(yán)重凋亡，相對(duì)的雜合子小鼠則可以成活且其表型正常。在非洲爪蛙的早期發(fā)育中，不同時(shí)間和空間BIP mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)不同方式;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可以促進(jìn)BIP mRNA在相應(yīng)胚胎結(jié)構(gòu)內(nèi)的表達(dá)［14］。文獻(xiàn)報(bào)道［15］，BIP 在胚胎發(fā)生過程中表達(dá)而且RA可以激活胚胎瘤細(xì)胞內(nèi)的BIP啟動(dòng)子。此外，RA在胚胎發(fā)育中扮演重要角色［16］，同時(shí)也參與干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞、造血母細(xì)胞和心肌細(xì)胞等功能性細(xì)胞的定向分化［17－20］。因此本研究采用含RA的mTeSRTM1誘導(dǎo)H9細(xì)胞分化，以探索HESC在發(fā)育研究中的潛在作用。我們發(fā)現(xiàn)隨RA誘導(dǎo)分化BIP蛋白表達(dá)逐漸升高，一方面驗(yàn)證了RA對(duì)BIP的調(diào)節(jié)功能，一方面也提示BIP蛋白在發(fā)育過程中的潛在作用，為干細(xì)胞分化用于發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了較明確的實(shí)驗(yàn)支持。

Fig 3 Neurons derived from H9 cells

Fig 4 Upregulation of BIP in differentiated H9 cells

綜上所述，HESC的神經(jīng)分化，使大規(guī)模的衍生神經(jīng)細(xì)胞的獲得成為可能，為相關(guān)神經(jīng)疾病的研究和藥物篩選研究提供潛在的細(xì)胞來源和平臺(tái)。而RA誘導(dǎo)的HESC的分化，可為發(fā)育生物學(xué)研究提供較好的體外研究平臺(tái)。

［1］Nishikawa S，Jakt L M，Era T.Embryonic stem-cell culture as a tool for developmental cell biology［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(6):502 －7.

［2］Klimanskaya I，Rosenthal N，Lanza R.Derive and conquer:sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7(2):131 －42.

［3］Dhara S K，Stice S L.Neural differentiation of human embryonic stem cells［J］.J Cell Biochem，2008，105(3):633 －40.

［4］Lin S，Talbot P.Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells［J］.Methods Mol Biol，2011，690:31 －56

［5］Erceg S，Lainez S，Ronaghi M，et al.Differentiation of human embryonic stem cells to regional specific neural precursors in chemically defined medium conditions［J］.PLoS One，2008，3(5):e2122.

［6］Fang S，F(xiàn)errone M，Yang C，et al.The tumor autocrine motility factor receptor，gp78，is a ubiquitin protein ligase implicated in degradation from the endoplasmic reticulum［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(25):14422－7.

［7］Singec I，Jandial R，Crain A，et al.The leading edge of stem cell therapeutics［J］.Annu Rev Med，2007，58:313 －28.

［8］Cervera R P，Stojkovic M.Human embryonic stem cell derivation and nuclear transfer:impact on regenerative therapeutics and drug discovery［J］.Clin Pharmacol Ther，2007，82(3):310 －5.

［9］周會(huì)芳，王 麗，張艷軍，邊育紅.胚胎干細(xì)胞的代謝組學(xué)方法在毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(2):149－52.

［9］Zhou H F，Wang L，Zhang Y J，Bian Y H.The progress in application of embryonic stem cell-based metabonom ics in toxicology research［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(2):149 －52.

［10］Yap L Y，Li J，Phang I Y，et al.Defining a threshold surface density of vitronectin for the stable expansion of human embryonic stem cells［J］.Tissue Eng Part C Methods，2011，17(2):193 －207.

［11］Elefanty A G，Stanley E G.Defined substrates for pluripotent stem cells:are we there yet［J］.Nature Methods，2010，7:967 －8.

［12］Wang M，Wey S，Zhang Y，et al.Role of the unfolded protein response regulator GRP78/BiP in development，cancer，and neurological disorders［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(9):2307－16.

［13］Luo S，Mao C，Lee B，Lee A S.GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development［J］.Mol Cell Biol，2006，26(15):5688－97

［14］Miskovic D，Heikkila J J.Constitutive and stress-inducible expression of the endoplasmic reticulum heat shock protein 70 gene family member，immunoglobulin-binding protein(BiP)，during Xenopus laevis early development［J］.Dev Genet，1999，25(1):31 －9.

［15］Kim S K，Kim Y K，Lee A S.Expression of the glucose-regulated proteins(GRP94 and GRP78)in differentiated and undifferentiated mouse embryonic cells and the use of the GRP78 promoter as an expression system in embryonic cells［J］.Differentiation，1990，42(3):153－9.

［16］Mark M，Ghyselinck N B，Chambon P.Function of retinoic acid receptors during embryonic development［J］.Nucl Recept Signal，2009，7:e002

［17］Christie V B，Maltman D J，Henderson A P，et al.Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesisin vitro［J］.J Neurosci Methods，2010，193(2):239 －45.

［18］Yu C，Liu Y，Miao Z，et al.Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cellderived hemato-vascular precursors［J］.Blood，2010，116(23):4786－94

［19］許秋巖，趙詠梅，王一松，等.Kip1在RA誘導(dǎo)人神經(jīng)前體細(xì)胞分化中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(2):219－22

［19］Xu Q Y，Zhao Y M，Wang Y S，et al.The role of accumulation of p27Kip1 in RA induced growth arrest and neuronal differentiation of human neural progenitor cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(2):219－22.

［20］Zhang Q，Jiang J，Han P，et al.Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals［J］.Cell Res，2010，21(4):579 －87.