HPLC法同時(shí)測(cè)定四逆湯中3種有效成分的含量

高志祥，姜笑寒，王巖，王琳，姜志明，孟繁浩

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001；2.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣州 510663；3.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110015）

四逆湯為張仲景所創(chuàng)名方，始載于《傷寒論》，為歷版中國(guó)藥典所收載的成方。本方由附子、干姜、甘草組成，配伍極為精簡(jiǎn)嚴(yán)謹(jǐn)。其功效為回陽(yáng)救逆，主治少陽(yáng)病。癥見陽(yáng)虛欲絕、冷汗自出、四肢厥逆、惡寒倦臥、嘔吐不渴、腹痛下利、神衰欲寐、舌苔白滑、脈象微細(xì)等癥。在現(xiàn)代臨床中應(yīng)用廣泛，并均收到良好的療效。其方劑也成為現(xiàn)代中藥研究的首選之一［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為四逆湯有強(qiáng)心、抗休克、保護(hù)受損傷心血管系統(tǒng)、抗血脂及對(duì)病理狀態(tài)下的機(jī)體有免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［2］，同時(shí)還具有保護(hù)腸黏膜及腦缺血等療效［3］。研究表明烏頭類生物堿既是其強(qiáng)心作用的有效成分又是其毒性成分［4］。為了更好的控制該藥品的內(nèi)在質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，本研究選用烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿作為四逆湯質(zhì)量控制的指標(biāo)，采用高效液相色譜法對(duì)其成分進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑：Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Agilent 1200系列雙元泵，Agilent 1200可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent 1200化學(xué)工作站；SB25-120超聲清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110720-200410）、新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：799-9403）和次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：798-9403）均有中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，三乙胺為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），流速為 1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，柱溫為30℃。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備：采用十萬(wàn)分之一天平精密稱取烏頭堿對(duì)照品3.01 mg、新烏頭堿對(duì)照品1.03 mg、次烏頭堿對(duì)照品2.02 mg，置于一10 mL瓶中，加入甲醇使溶解并稀釋刻度，混勻，得到混合對(duì)照品貯備液。

1.2.3 供試品溶液的制備：參照中國(guó)藥典（2005年第一部）第422頁(yè)方法制成四逆湯，減壓濃縮成稠膏狀。加入甲醇使溶解并超聲提取10 min，放至室溫，加入甲醇定容至10 mL，搖勻，過(guò)0.45μm的微孔濾膜，即得。

1.2.4 陰性樣品的制備：按1.2.3項(xiàng)下的方法不加附子制備而成。

1.2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：在“1.2.1”的色譜條件下進(jìn)樣，以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿色譜峰計(jì)算，理論板數(shù)均在5 000以上時(shí)，色譜峰對(duì)稱因子0.95~1.05，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿色譜峰與其他成分分離度大于1.5。

1.2.6 線性關(guān)系的考察：精密量取混合對(duì)照品貯備液適量，采用逐級(jí)稀釋法配制成分別含烏頭堿301、150.5、60.2、30.1、6.02 μg/mL，新烏頭堿 103、51.5、20.6、10.3、2.06 μg/mL，次烏頭堿 202、101、40.4、20.2、4.04μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）做線性回歸。

1.2.7 精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰RSD分別為0.79%、0.37%、0.90%。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為201001的供試品溶液分別于 0、4、8、16、24 h 進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定峰面積。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰RSD分別為0.29%、0.32%、0.64%。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)：取批號(hào)為201001供試品，精密稱定5份，測(cè)定含量。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量的RSD分別為1.05%、0.94%和0.98%。

1.2.10 回收率試驗(yàn)：取批號(hào)為201001的樣品，精密稱定6份，分別置10 mL量瓶中，精密加入19μg/mL烏頭堿對(duì)照品溶液1 mL，10μg/mL新烏頭堿對(duì)照品溶液1 mL，400μg/mL次烏頭堿對(duì)照品溶液1 mL，定容至10 mL。依法測(cè)定，計(jì)算回收率。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均回收率分別為100.74%（RSD=1.88%）、99.9%（RSD=2.98%） 和 102.9%（RSD=1.32%）。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品、供試品及陰性樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（A）、供試品溶液（B）陰性樣品（C）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards（A），sample（B）and feminine sample（C）

2.2 樣品的測(cè)定

按照中國(guó)藥典2005年版一部422頁(yè)方法制備四逆湯樣品5批，按“1.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，見表1。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相選用甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），葛爾寧等［5］也進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）為流動(dòng)相，其流動(dòng)相較復(fù)雜。本方法創(chuàng)新之處在流動(dòng)相中去掉了塑形劑氯仿，分離效果良好，而且流動(dòng)相更為溫和，有利于色譜柱的長(zhǎng)期使用，方法簡(jiǎn)便可行。同時(shí)通過(guò)考察不同比例的甲醇-0.1%三乙胺（50∶50；55∶45；60∶40；65∶35）對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明甲醇-0.1%三乙胺（65∶35）對(duì)3種生物堿的分離最好。

3.2 提取時(shí)間的選擇

生附子中的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿均為劇毒生物堿，有報(bào)道稱3 mg的烏頭堿即可以使人死亡［6］，因此提取時(shí)間的選擇就顯得尤為重要，提取時(shí)間過(guò)短則劇毒性烏頭堿含量過(guò)大，過(guò)長(zhǎng)則有效成分的活性會(huì)大大降低。葛爾寧等在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)四逆湯中附子、干姜和甘草在滾煎時(shí)70 min中后烏頭堿的含量減半。線性范圍大大增大、更有利于對(duì)四逆湯進(jìn)行質(zhì)量控制。

表1 四逆湯樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=5）Tab.1 The quantitative results of Sinitang（n=5）

［1］王曉琳.中藥方劑“四逆湯”分析［J］.中醫(yī)中藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（6）：104.

［2］劉平，葛迎春，馬天舒.四逆湯類方藥理研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（2）：248-251.

［3］商李超，郁寶生.四逆湯的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2009，7（11）：1333-1335.

［4］肖鳳霞，周莉玲，李銳.四逆湯制劑中烏頭生物堿的藥動(dòng)學(xué)相關(guān)性研究［J］.中藥材，2005，28（7）：587-588.

［5］葛爾寧.通脈四逆湯毒性分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12（5）：12-14.

［6］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：138.