局部高頻電刺激海馬對(duì)海人酸致癇大鼠海馬細(xì)胞外谷氨酸和γ-氨基丁酸釋放的影響*

林婉揮，黃華品，林明星，陳圣根

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350001)

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高，近30%發(fā)展為難治性癲癇。其中一部分病人可通過手術(shù)獲得明顯效果，但仍有一部分病人不適合手術(shù)治療或者手術(shù)治療無效。而腦深部電刺激(deep brain stimulation，DBS)用來治療頑固性癲癇已有較長的歷史，其治療結(jié)果令人鼓舞。其主要的刺激靶點(diǎn)有小腦、丘腦中央中核、丘腦底核(subthalanuc nucleus，STN)、丘腦前核、尾狀核、蒼白球、海馬、皮質(zhì)局限性病灶等，其中STN備受關(guān)注。近期，Handforth等[1]研究發(fā)現(xiàn)，給予雙側(cè)丘腦底核電刺激可以減少部分性癲癇患者的發(fā)作頻率和緩解發(fā)作程度，但不能阻止癲癇發(fā)作所致的繼發(fā)性損傷，與抗癲癇藥物的療效相比，并無明顯優(yōu)越性。因此有必要尋找其他刺激部位以提高療效。通常認(rèn)為丘腦是大腦皮質(zhì)興奮的起搏器，而顳葉癲癇的海馬異常放電可引起丘腦的異常電活動(dòng)，并向上傳播使大腦皮質(zhì)異常放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。電刺激邊緣系統(tǒng)已經(jīng)成功的應(yīng)用于治療顳葉癲癇病人，同樣也能控制癲癇動(dòng)物模型的發(fā)作[2]。其可能的機(jī)制是高頻電刺激海馬抑制了興奮性氨基酸神經(jīng)元的輸出，阻止了丘腦向大腦皮質(zhì)的異常放電的傳播，即通過調(diào)節(jié)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的平衡起到治療顳葉癲癇的作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)在觀察高頻電刺激海馬對(duì)海人酸致癇大鼠癲癇發(fā)作影響的同時(shí)，利用腦微透析技術(shù)聯(lián)合高效液相分析技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)海馬細(xì)胞外液谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)的濃度變化，以探討高頻電刺激海馬治療癲癇可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SD清潔級(jí)雄性成年大鼠40只，體質(zhì)量200～250g，2個(gè)月齡，購自中國上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，12 h光照12 h黑暗交替，自由攝取食物和水。海人酸、Glu標(biāo)準(zhǔn)品、GABA 標(biāo)準(zhǔn)品、EDTA、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇(均購自美國Sigma公司)，甲醇為色譜醇(德國Merk公司)。

1.2 癲癇模型的建立

將動(dòng)物先分成兩大組:空白組(10只)、海人酸組(30只)。海人酸組予腹腔注射海人酸(10mg/kg)，30min后如無Ⅳ級(jí)(按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4])以上發(fā)作，每隔15 min注射1 mg/kg追加劑量，直至出現(xiàn)3次Ⅳ級(jí)以上發(fā)作方認(rèn)為癲癇模型成功。注射后14天內(nèi)利用視頻腦電儀(型號(hào)KT-88-2400，北京康泰)大鼠行為學(xué)和皮層腦電圖變化?？瞻捉M則予海人酸相同體積量生理鹽水腹腔注射。

1.3 植入刺激電極

海人酸組隨機(jī)分為3組(n=10):海人酸組未予其他處理，假刺激組予植入刺激電極但未刺激，電刺激組。10%水合氯醛(2 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，在腦立體定位儀(Stoelting公司)的幫助下將同心圓式自制電極緩慢插入右側(cè)海馬(前囟后4.8 mm，矢狀右旁開5.2 mm，水平面下7.0mm，前后囟距離9.0mm)，牙托粉固定。連接YC-2型程控電刺激器(成都儀器廠)，模型制作成功后予進(jìn)行電刺激，每天至少30min，直至癲癇波明顯減少，刺激參數(shù):強(qiáng)度100UA ，波寬60US，頻率130Hz。

1.4 腦微透析方法的建立

在腦立體定位儀的幫助下將微透析引導(dǎo)管植入右側(cè)海馬(前囟后4.8 mm，矢狀右旁開5.0mm，水平面下4.6 mm，)，套上項(xiàng)圈，術(shù)后置于單籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d開始微透析實(shí)驗(yàn):在大鼠清醒狀態(tài)下移去引導(dǎo)管針芯，植入CMA/12微透析針(內(nèi)徑0.05 mm，膜長4 mm，瑞典CMA公司)，項(xiàng)圈固定在大鼠自由活動(dòng)裝置儀上，微透析針輸入端與CMA/102微量注射泵相連，輸出端接CMA170冷收集器，微量泵內(nèi)充滿人工腦脊液，以2μl/min速率持續(xù)灌注，灌注2 h平衡后開始收集微透析液，每管收集15 min，分別在注射前、注射后30min、第 1天、第 4天、第 7天、第14天連續(xù)采集3管，存入-80℃冰箱擇期檢測(cè)。

1.5 高效液相-熒光檢測(cè)器(美國 Waters公司)柱前衍生法檢測(cè)透析液中Glu、GABA的濃度

13.5 mg OPA 、500μl MeOH 、5μl β-巰基乙醇加入4.5 ml硼酸鹽緩沖液混勻，檢測(cè)前予硼酸鹽緩沖液稀釋 2 倍，取 20μl與 35μl硼酸鹽緩沖液及 5μl透析樣品混勻，靜置約1 min待衍生反應(yīng)完全后，吸20μl注入進(jìn)樣器。色譜條件:檢測(cè)系統(tǒng)為Multiλ Fluorescence Detector(Waters 2475)，反相色譜柱 Nova-pak C18(150mm ×3.9mm ，粒徑5μm)，利用單泵恒流洗脫，設(shè)定柱溫30℃，流速1.0ml/min，熒光檢測(cè)器設(shè)定激發(fā)波長為Ex330nm，發(fā)射波長為Em420nm，流動(dòng)相為:0.1 mol/L磷酸氫二鈉，1 mmol/L EDTA和25%MeOH，調(diào)pH值至6.4。檢測(cè)后采用Empower分析軟件對(duì)峰下面積積分，再以標(biāo)準(zhǔn)品濃度-峰下面積做校正曲線，計(jì)算樣品的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)和腦電變化

2.1.1 大鼠行為學(xué)改變 空白組(KB)大鼠行為學(xué)未見癲癇發(fā)作;致癇組呈現(xiàn)急性期、靜止期、慢性期改變。從圖1A看出:與海人酸組(KA)比較電刺激組(DBS)明顯減少慢性期反復(fù)自發(fā)性發(fā)作的次數(shù)(P＜0.05);而假刺激組(Pseudo-DBS)則無明顯改變。

2.1.2 大鼠腦電圖改變 如圖1C中的圖(a)所示，海人酸注射前以α波為主，海人酸注射后急性期以陣發(fā)性棘波、尖波為主如圖(b)，靜止期以α波為主以及散在慢波如圖(c)，慢性期出現(xiàn)陣發(fā)性的棘慢復(fù)合波如圖(d)。電刺激能明顯減少癇性放電頻率(P＜0.05);而假刺激組則無明顯改變(P＞0.05，圖1B)。

2.2 不同時(shí)間大鼠海馬細(xì)胞外Glu的濃度變化

如圖2所示，注射海人酸前4組的基礎(chǔ)值無明顯差異，注射海人酸后與空白組(KB)比較海人酸組、假刺激組、電刺激組的Glu均明顯升高，以第1天最為顯著(250%左右)，并持續(xù)至第14天(150%左右)，與海人酸組比較電刺激組Glu明顯下降(P＜0.01)，而假刺激組則無明顯改變;與假刺激組比較電刺激組Glu也明顯下降(P＜0.01)。

Fig.1 Change of EEG and Behaviour

2.3 不同時(shí)間大鼠海馬細(xì)胞外GABA的濃度變化

如圖3所示，注射海人酸前4組的基礎(chǔ)值無明顯差異，注射海人酸后與空白組比較海人酸組、假刺激組、電刺激組的GABA于第1天明顯升高(200%左右，P＜0.01)，后逐漸下降于第4天保持120%水平;電刺激組與海人酸組、假刺激組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)海馬細(xì)胞外Glu/GABA的比值變化

如圖4所示，注射海人酸后比值升高，第4天最高，近2倍;電刺激組的比值較海人酸組和假刺激組有所下降(P＜0.05)，至第14天接近正常水平。

Fig.2 Content of EC glutamate(Glu)in the hippocampus of rats

Fig.3 Content of EC of GABA in the hippocampus of rats

Fig.4 Change of Glu/GABA ratio

3 討論

本研究在觀察高頻電刺激海馬治療海人酸致癲癇大鼠效果的同時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)海馬細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)的變化，以探討高頻電刺激治療癲癇可能的機(jī)制。研究結(jié)果顯示高頻電刺激海馬能明顯減少海人酸致癇大鼠的自發(fā)性發(fā)作，同樣能減少腦電圖癇性放電，說明了電刺激海馬癲癇灶，可能作為一個(gè)有效的控制癲癇發(fā)作的方法。

關(guān)于癲癇的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，其機(jī)制之一是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡。Glu是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，致癇后其水平常升高，參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。GABA是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，致癇后其改變結(jié)果不一，但兩者的失衡可能是癲癇發(fā)作的機(jī)制之一。本結(jié)果顯示海人酸注射后海馬細(xì)胞外Glu濃度明顯升高，支持了Glu參與了癲癇的啟動(dòng)的論點(diǎn)[3]，至慢性期有所下降仍保持較高的水平，這是癲癇活動(dòng)的結(jié)果同時(shí)也是維持癲癇所必需的[3]。而海人酸致癇后海馬細(xì)胞外GABA的濃度也有所升高，至慢性期保持高于正常水平，這和以往的實(shí)驗(yàn)似乎不同[5-6]，可能是機(jī)體自我保護(hù)的結(jié)果。海馬神經(jīng)元幾乎沒有GABA囊泡，海人酸刺激后并沒有立即引起GABA的大量釋放，而是由于Glu大量增加后引起一系列細(xì)胞毒性的同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞立即通過轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)Glu進(jìn)行重?cái)z取，其代謝產(chǎn)物也能合成GABA，然后轉(zhuǎn)給中間神經(jīng)元，起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。還有，致癇后Glu/GABA的比值升高，至慢性期出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作時(shí)其比值仍高于空白組，這也說明了主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡是癲癇形成的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果顯示電刺激能降低海馬細(xì)胞外Glu的水平，使Glu/GABA的比值下降，至第14天趨于正常，而Glu的降低并不伴隨著GABA的變化，說明高頻電刺激海馬控制癲癇并不能簡單解釋為像電刺激STN產(chǎn)生類似毀損的效果。通常認(rèn)為，丘腦是大腦皮質(zhì)興奮的起搏器，Papez環(huán)路(邊緣系統(tǒng))則將海馬連接至丘腦、扣帶回、內(nèi)嗅區(qū)、海馬回。高頻電刺激使海馬至丘腦的Glu能神經(jīng)元輸出減少，阻斷了Papez環(huán)路及海馬-皮質(zhì)回路，抑制了海馬的過度興奮及海馬向皮質(zhì)傳遞異常放電。關(guān)于腦深部電刺激治療癲癇可能作用機(jī)制，人們提出了四種假設(shè)[7]:(1)去極化阻滯;(2)突觸抑制;(3)突觸阻抑:高頻刺激使得神經(jīng)遞質(zhì)耗竭，阻礙突觸信息傳遞從而影響了電極周圍的神經(jīng)信號(hào)的輸出;(4)刺激改變了病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能。本研究結(jié)果顯示一方面，高頻電刺激海馬能選擇性地耗竭海馬突觸周圍的Glu，使其與海人酸受體結(jié)合減少，引起細(xì)胞膜對(duì)鈉、鈣離子的通透性降低，減少了鈉、鈣離子進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化受阻滯，抑制了異常放電的傳播;另一方面，電刺激時(shí)，電極植入復(fù)雜的容積導(dǎo)體中，其周圍有神經(jīng)元胞體、軸突、樹突，電刺激可同時(shí)影響局部神經(jīng)元、其傳入、傳出投射纖維以及與其周圍相互連續(xù)的神經(jīng)纖維[8]，因此直接或間接地抑制了異常電活動(dòng)的擴(kuò)布;還有，海馬區(qū)興奮性氨基酸Glu量的減少抑制了病理性的長時(shí)程突觸增強(qiáng)(LTP)，同時(shí)高頻電刺激(130Hz)能激活了有效的LTP，從而改變病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能[9].因此電刺激治療癲癇并不能簡單解釋為神經(jīng)元的抑制，是多方面同時(shí)作用的結(jié)果。

關(guān)于電刺激對(duì)海馬細(xì)胞外GABA的影響，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)電刺激沒有改變海馬細(xì)胞外GABA的濃度。這可能與海馬神經(jīng)元本身幾乎沒有GABA囊泡有關(guān)。但有研究表明海馬CA1區(qū)GABA神經(jīng)元與Glu存在著復(fù)雜的突觸聯(lián)系[10]，本實(shí)驗(yàn)研究表明電刺激后Glu/GABA的比值下降，時(shí)間越長越趨于正常，說明了電刺激可能通過調(diào)節(jié)Glu/GABA的比值達(dá)到抗癲癇的效果。

總之，本研究結(jié)果表明高頻電刺激海馬能減少癲癇的自發(fā)性發(fā)作，選擇性地耗竭海馬細(xì)胞外Glu的水平，在高頻電刺激海馬控制癲癇中起到重要的作用。其機(jī)制不能簡單解釋為神經(jīng)元的抑制，是多方面同時(shí)作用的結(jié)果。此外電刺激并不影響GABA的釋放。

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