小鼠負(fù)重游泳后血清代謝模式變化分析*

吳健全，郭長江，高蔚娜，劉 晉，韋京豫，楊繼軍

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050)

在運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)體的工作能力或工作效率下降，不能維持在特定水平上，經(jīng)過適當(dāng)休息可以恢復(fù)的生理現(xiàn)象，稱為運(yùn)動(dòng)性疲勞。對于疲勞的研究已逾百年歷史，但疲勞發(fā)生的具體機(jī)制目前仍未十分明了。許多假說用來解釋疲勞現(xiàn)象[1]，如代謝物堵塞、能源耗竭、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)、保護(hù)性抑制、神經(jīng)-肌肉疲勞控制鏈“突變”理論等。這些學(xué)說都曾成功解釋了疲勞某一方面現(xiàn)象，在運(yùn)動(dòng)性疲勞及其預(yù)防研究中發(fā)揮過一定的作用，但由于疲勞過程涉及骨骼肌、呼吸、循環(huán)、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等多系統(tǒng)功能，表現(xiàn)為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)，目前還沒有一種理論能夠完全把握疲勞過程中的各種現(xiàn)象。

代謝組學(xué)是一種新興的組學(xué)技術(shù)，通過測定生物樣品內(nèi)源性代謝產(chǎn)物含量，并采用模式識別方法對機(jī)體代謝表型進(jìn)行分析，高通量、全景式研究生物體在生理、病理等狀況下發(fā)生的各種代謝動(dòng)態(tài)變化，有助于發(fā)現(xiàn)外來因素對機(jī)體發(fā)揮作用的靶器官和位點(diǎn)，確定特異性生物標(biāo)記物，為作用機(jī)制研究提供新的研究方向或思路[2]。

本研究以非耐力訓(xùn)練小鼠為研究對象，采用一次性負(fù)重游泳方式建立疲勞模型，采用代謝組學(xué)分析方法研究疲勞過程機(jī)體代謝表型變化，從物質(zhì)和能量代謝角度探討疲勞過程及其機(jī)制，為正常人群疲勞干預(yù)措施研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量18～20g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2007-004。

1.2 方法

小鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組5只。分別為正常對照組和3個(gè)運(yùn)動(dòng)組，均給予AIN-93合成飼料，喂養(yǎng)14 d。喂養(yǎng)期間小鼠適應(yīng)性游泳2次，每次10min。第15天運(yùn)動(dòng)組小鼠尾部系相當(dāng)體重2%的鉛絲，置水溫35℃，水深30cm的桶中進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，時(shí)間分別為30min，60min和120min。游泳后擦干動(dòng)物體表水分，乙醚麻醉，摘眼球取血，分離血清，-20℃凍存。

1.3 1H NMR分析

離心管中加入 100μl 3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉(TSP，Merck)的重水(D2O，美國Cambridge Isotope Laboratories)溶液(1mg/ml)，150μl血清以及 350μl重水，充分震蕩混勻后，用 Eppendorf MiniSpin Plus型離心機(jī)13000r/min離心10min。取550μl上清加入核磁共振管中待用。

在Varian INOVA 600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀(美國Varian)上調(diào)用馳豫編輯(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)和擴(kuò)散 編輯(Long-eddy-delay，LED)脈沖序列對樣品進(jìn)行檢測。CPMG譜寬為8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，采樣時(shí)間2 s，累加次數(shù)128次，其間采用低功率脈沖對水峰進(jìn)行預(yù)飽和。LED譜寬為8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，采樣時(shí)間2 s，累加次數(shù)128次，擴(kuò)散時(shí)間為100ms，其間采用低功率脈沖對水峰進(jìn)行預(yù)飽和。在對自由感應(yīng)衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號數(shù)據(jù)進(jìn)行填零，分別加上0.5 Hz(CPMG實(shí)驗(yàn))和3 Hz(LED實(shí)驗(yàn))的線增寬因子后進(jìn)行傅立葉變換轉(zhuǎn)得到1H NMR譜圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側(cè)峰定為δ 1.33。

1.4 數(shù)據(jù)處理

CPMG數(shù)據(jù)和LED數(shù)據(jù)分段積分，將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存，以SIMCA-P+軟件(v10.04，Umetrics，Umea，Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化(mean centering)或Pareto標(biāo)度化進(jìn)行預(yù)處理之后采用PCA分析。為強(qiáng)化組間差異，進(jìn)一步采用PLS-DA或OSC分析。分析結(jié)果以得分圖(scores plot)和載荷圖(loadings plot)的形式表示。得分圖采用各樣本在前2個(gè)主成分坐標(biāo)中的位置來表示，反映樣本間的分布，從中可以得出樣本之間的差異;載荷圖反映各積分段對樣本主成分得分值的貢獻(xiàn)大小，結(jié)合得分圖中組間分布差異，可找出對這種差異貢獻(xiàn)較大的一些積分段;由其對應(yīng)的化學(xué)位移并結(jié)合1H NMR譜圖，可確定相應(yīng)的代謝物，從而對樣品中某些代謝物的變化及其可能意義進(jìn)行深入分析。

2 結(jié)果

2.1 負(fù)重游泳后小鼠血清1H NMR圖譜的變化

從小鼠血清CPMG1H NMR譜可看出，小鼠血樣內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物隨游泳時(shí)間而發(fā)生變化，各主要波峰的歸屬為β-羥丁酸(1.2)、乳酸(1.31-1.33，4.10-4.12)、乙酸(1.92)、丙酮(2.22)、丙酮酸(2.26)、膽堿(3.20)、磷酸膽堿(3.22，3.23)、丙氨酸(1.46，1.47)、葡萄糖(3.4～4.0)、脂類(0.86)等。運(yùn)動(dòng)過程中乳酸、β-羥丁酸、丙酮、脂類等譜峰隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間不斷增大，而糖類則相反。另外運(yùn)動(dòng)過程中膽堿和磷酸膽堿譜峰減小也是較典型改變(圖1)。

小鼠血清LED1H NMR譜顯示運(yùn)動(dòng)過程中血清脂類相關(guān)代謝產(chǎn)物隨游泳時(shí)間也發(fā)生相應(yīng)變化，主要波峰有極低密度脂蛋白(VLDL，1.18，1.34，1.38)、低密度脂蛋白(LDL ，0.9，1.3)、高密度脂蛋白(HDL，0.82，0.86，1.26)、不飽和脂肪酸(5.3)、脂質(zhì)(1.58)、磷脂酰膽堿(3.22)、N-乙酰糖蛋白(N-acetylglycoprotein，2.02)、O-乙酰糖蛋白(O-acetylglycoprotein，2.14)。運(yùn)動(dòng)后脂蛋白、不飽和脂肪酸、脂質(zhì)、NAc譜峰明顯增大，磷脂酰膽堿、OAc譜峰減小。

2.2 CPMG實(shí)驗(yàn)1H NMR圖譜模式識別

小鼠血清CPMG實(shí)驗(yàn)1H NMR譜波峰積分值的PLS-DA結(jié)果見圖2。3個(gè)游泳組代謝模式與正常對照組有明顯差異，隨著游泳時(shí)間延長差異有逐漸增大的趨勢。從因子載荷圖中可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致這種差異的主要代謝產(chǎn)物，其中較正常對照組升高的化合物有β-羥丁酸、乙酸、乳酸，降低的化合物有葡萄糖、膽堿、磷酸膽堿、丙氨酸等。

2.3 LED實(shí)驗(yàn)1H NMR圖譜模式識別

正常對照組與其他三組基本沿t1方向分離，30min組、120min組沿t2方向與60min游泳組有一定差異。從因子載荷圖可以看出，與正常對照組相比，游泳后小鼠血清磷脂酰膽堿水平降低，而HDL、LDL和VLDL等脂蛋白以及不飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、脂質(zhì)水平等均明顯升高。排除正常對照組，對3個(gè)游泳組進(jìn)行比較，結(jié)果表明，隨著游泳時(shí)間延長，HDL、LDL和VLDL等脂蛋白以及不飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、脂質(zhì)水平均相應(yīng)升高，而磷脂酰膽堿水平則逐漸降低。

Fig.1 Serum spectra of 600-MHz 1H NMR in rats after different time of loading swimming

3 討論

用于運(yùn)動(dòng)性疲勞研究的模型有多種，本研究以非耐力訓(xùn)練的小鼠為研究對象，采用一次性負(fù)重游泳的方式建立疲勞模型，可以直接分析疲勞過程生理、生化改變，避免反復(fù)訓(xùn)練過程由于疲勞-恢復(fù)-適應(yīng)等過程帶來的影響，結(jié)果更適用于針對一般人群或非訓(xùn)練人群的代謝研究需要。

Fig.2 Scores and loading plot derived from CPMG 1H NMR of the mice serum

Fig.3 Scores and loading plot from LED 1H NMR of the mice serum

代謝組分析結(jié)果表明，疲勞后血清成分發(fā)生顯著變化，對代謝表型改變具有明顯貢獻(xiàn)的化合物主要有三大營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝中間產(chǎn)物如β-羥基丁酸、乳酸、丙氨酸、葡萄糖、脂蛋白、糖蛋白、脂肪酸等，與文獻(xiàn)報(bào)告基本一致[3]。另外本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)過程中膽堿、磷酸膽堿和磷脂酰膽堿水平較正常對照組均明顯降低，值得關(guān)注。運(yùn)動(dòng)過程隨著糖類物質(zhì)大量消耗，脂肪動(dòng)員加強(qiáng)，導(dǎo)致大量游離脂肪酸釋放入血，長鏈脂肪酸必須經(jīng)活化成脂酰CoA，再通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ轉(zhuǎn)運(yùn)，才能進(jìn)入線粒體內(nèi)膜氧化[4]。如果游離脂肪酸不能與肉堿結(jié)合，就會通過脂肪酸穿梭作用破壞線粒體膜電位，干擾ATP合成[5]。肉堿的生物合成需要S-腺苷甲硫氨酸提供活性甲基供體。膽堿可以氧化為甜菜堿參與蛋氨酸再甲基化途徑，間接參與S-腺苷甲硫氨酸的合成。在蛋氨酸再甲基化途徑中，高半胱氨酸在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，可由甜菜堿提供活性甲基轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)源性蛋氨酸，繼而在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM)參與肉堿合成代謝[6]。因此膽堿可能通過參與肉堿合成而影響脂肪酸氧化。運(yùn)動(dòng)后機(jī)體膽堿和磷酸膽堿水平均下降可能是制約機(jī)體脂肪酸氧化供能的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這可能是導(dǎo)致機(jī)體能量合成不足以及出現(xiàn)疲勞的一個(gè)重要原因。作為代償機(jī)制，膜結(jié)構(gòu)中的磷脂酰膽堿可能部分分解釋放入血，這樣又可能導(dǎo)致膜正常結(jié)構(gòu)和功能的異常。本研究所觀察到的糖蛋白水平變化可能與之相關(guān)。N-乙酰糖蛋白和O-乙酰糖蛋白都是細(xì)胞膜正常組分，血中含量變化很可能是細(xì)胞膜受損傷的表現(xiàn)。

作為機(jī)體重要的甲基供體之一，膽堿類物質(zhì)還可能通過影響DNA甲基化從而調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)后基因表達(dá)，對機(jī)體代謝發(fā)揮作用。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的作用下，將SAM提供的甲基共價(jià)結(jié)合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上的過程，是最常見的表觀遺傳(epigenetic)現(xiàn)象[7]。合成SAM需要葉酸、VitB12、甲硫氨酸、膽堿和甜菜堿等營養(yǎng)物質(zhì)，膽堿缺乏可直接導(dǎo)致SAM水平降低，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多種結(jié)構(gòu)或功能基因低甲基化或超甲基化，表達(dá)出現(xiàn)異常，并導(dǎo)致機(jī)體功能異常改變[8]。運(yùn)動(dòng)后機(jī)體某些基因表達(dá)出現(xiàn)顯著改變，這些變化與運(yùn)動(dòng)過程機(jī)體代謝方式相適應(yīng)，機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有賴于不同表達(dá)基因間的相互作用與協(xié)調(diào)[9]。可以推測運(yùn)動(dòng)后機(jī)體膽堿類水平下降可能也會涉及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)相關(guān)基因甲基化異常，表達(dá)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致機(jī)體代謝出現(xiàn)紊亂，這可能是疲勞發(fā)生的另一個(gè)重要原因。

綜上所述，本研究采用1H NMR方法分析了不同時(shí)間負(fù)重游泳對小鼠血清代謝組的影響，探討了本研究模型中物質(zhì)代謝的基本特點(diǎn)及其變化規(guī)律。結(jié)合運(yùn)動(dòng)過程中能量代謝特點(diǎn)以及脂肪動(dòng)員的特殊意義，針對膽堿類物質(zhì)代謝規(guī)律和作用開展?fàn)I養(yǎng)抗疲勞研究應(yīng)該是一項(xiàng)值得考慮的工作。

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