七葉皂苷鈉對(duì)腸缺血/再灌注腸過(guò)氧化損傷的影響*

王艷蕾，景友玲，蔡慶艷，崔國(guó)金，張一兵，王艷偉

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，2.唐山鋼鐵公司醫(yī)院藥劑科，唐山 063000)

腸缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是外科常見(jiàn)的組織器官損傷之一，在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、心肺功能不全等疾患的病理過(guò)程中起重要作用。七葉皂苷鈉(sodium aescinate，SA)在臨床上主要用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致的腫脹。近年研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉還具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等作用[1]，但其對(duì)腸I/R損傷的影響的報(bào)道尚少，本研究旨在探討腸I/R腸過(guò)氧化損傷及七葉皂苷鈉對(duì)其防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

24只雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，本院動(dòng)物中心提供。普通動(dòng)物常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。七葉皂苷鈉(山東綠葉制藥有限公司，批號(hào)H20003239);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、二胺氧化酶(DAO)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)試盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 腸I/R模型制備 腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉，分離左頸總動(dòng)脈。全身肝素化后頸總動(dòng)脈插管連接壓力傳感器通過(guò)BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP);然后行腹部手術(shù)，分離出腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)，在其根部用無(wú)創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷該動(dòng)脈血運(yùn)1 h后松夾，恢復(fù)血流后觀察1 h，造成腸I/R損傷模型。

1.2.2 動(dòng)物分組和標(biāo)本采集 將動(dòng)物隨機(jī)分為3組(n=8):(1)假手術(shù)組:只分離腸系膜上動(dòng)脈，不行夾閉;(2)I/R組:方法見(jiàn)模型制備;(3)SA+I/R組:復(fù)制模型同前，于缺血前、再灌前、再灌后30min尾靜脈推注七葉皂苷鈉0.09 mg/100g;各組連續(xù)監(jiān)測(cè)缺血前、再灌前、再灌后的動(dòng)脈血壓，于松夾后1 h自腹主動(dòng)脈取血，同時(shí)取距回盲部2 cm以上的小腸組織10cm，一部分-70℃保存，待測(cè)相應(yīng)指標(biāo);一部分冰鹽水漂凈，濾紙吸干，待測(cè)腸組織濕/干比值及含水率;一部分經(jīng)福爾馬林固定，染色，光學(xué)顯微鏡觀察小腸組織的損傷程度。

1.2.3 腸組織濕/干比值及含水率的測(cè)定 取腸組織，吸干表面水分后稱重，為濕重(W)。置 80℃恒溫烤箱，干燥48 h至恒重后再稱重，為干重(D)。計(jì)算腸組織濕重與干重比值(wet/dry weight ratio，W/D)和腸含水率=(濕重-干重)/濕重×100%，表示腸組織水腫形成情況，間接反映腸黏膜毛細(xì)血管的通透性。

1.2.4 檢測(cè)方法 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、二胺氧化酶(DAO)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)的測(cè)定按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 I/R時(shí)MAP的變化及七葉皂苷鈉的影響

I/R組血壓夾閉后較缺血前略有下降，再灌后明顯下降，再灌前與缺血前無(wú)顯著差異，但與再灌后0.5 h相比差異顯著(P＜0.01)，再灌后1 h血壓下降更為明顯;再灌后0.5 h和1 h與Control組同時(shí)間點(diǎn)相比亦有顯著差異(P＜0.01);給予七葉皂苷鈉后，再灌后0.5 h和1 h血壓較I/R組明顯升高(P＜0.01)，但未達(dá)正常水平(表1)。

2.2 I/R時(shí)腸組織W/D和腸含水率的變化及七葉皂苷鈉的影響

I/R組腸組織W/D及腸含水率均顯著高于Control組(P＜0.01)，七葉皂苷鈉能顯著降低腸組織W/D及腸含水率(P均＜0.01)，且與Control組相比無(wú)顯著差異(表2)。

Tab.1 Changes of MAP(kPa，，n=8)

Tab.1 Changes of MAP(kPa，，n=8)

MAP:Mean arterial pressure;BI:Before ischemia;BR:Before reperfusion;AR:After reperfusion**P＜0.01 vs I/R group;##P＜0.01 vs before reperfusion;△△ P＜0.01 vs after reperfusion 0.5 h

Group BI BR AR-0.5 h AR-1 h Control 16.39±1.06 16.83±0.72 16.79±1.05** 16.84±0.81**I/R 16.91±1.03 16.37±1.07 8.51±1.33## 5.81±1.26△△SA+I/R 16.67±0.83 16.57±0.93 13.25±1.67**## 11.69±1.75**△△

Tab.2 Changesof intestine W/D and intestine water content(，n=8)

Tab.2 Changesof intestine W/D and intestine water content(，n=8)

W/D:Wet/dry weight ratio**P＜0.01 vs I/R group

Group Intestine W/D Intestine water content(%)Control 2.54±0.21** 58.77±4.26**I/R 3.63±0.28 72.38±1.98 SA+I/R 2.67±0.31** 62.25±4.20**

2.3 I/R時(shí)血漿 SOD、MPO、DAO活性和MDA含量的變化及七葉皂苷鈉的影響

I/R組血漿SOD活性降低，MPO、DAO活性及MDA含量升高，與Control組比較有顯著差異(P＜0.01);七葉皂苷鈉組與I/R組比較SOD活性升高，MPO、DAO活性及MDA含量降低(P＜0.01)，除DAO活性接近正常外，其他指標(biāo)均未達(dá)到正常水平(P＜0.01或0.05，表3)。

Tab.3 Changes of the activity of SOD，MPO，DAO and the content of MDA in plasma(，n=8)

Tab.3 Changes of the activity of SOD，MPO，DAO and the content of MDA in plasma(，n=8)

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;DAO:Diamine oxidase;MPO:Myeloperoxidase**P＜0.01 vs I/R group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group

Group SOD(U/ml) MPO(U/ml) DAO(U/L) MDA(nmol/ml)Control 275.72±9.15** 0.122±0.015** 11.79±1.78** 1.14±0.58**I/R 177.37±10.84 0.327±0.040 19.78±4.82 4.61±1.18 SA+I/R 226.27±22.07**## 0.211±0.041**## 14.48±1.47** 1.98±0.42**#

2.4 I/R時(shí)腸組織SOD、MPO、DAO活性和MDA含量的變化及七葉皂苷鈉的影響

與Control組比較，I/R組腸組織SOD、DAO活性降低，MPO活性及MDA含量升高(P＜0.01);七葉皂苷鈉組腸組織SOD、DAO活性升高，MPO活性及MDA含量降低，與I/R組比較有顯著差異(P＜0.01，表4)。

Tab.4 Changes of the activity of SOD，MPO，DAO and the content of MDA in intestine(，n=8)

Tab.4 Changes of the activity of SOD，MPO，DAO and the content of MDA in intestine(，n=8)

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;DAO:Diamine oxidase;MPO:Myeloperoxidase**P＜0.01 vs I/R group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group

Group SOD(U/mg pro) MPO(U/g) DAO(U/g pro) MDA(nmol/mg pro)Control 59.79±5.09** 0.378±0.033** 15.39±3.91** 2.83±0.47**I/R 38.01±3.24 3.159±0.364 7.03±0.95 7.29±0.87 SA+I/R 45.21±6.46**## 1.697±0.138**## 12.17±1.56**# 5.04±0.67**##

2.5 腸組織形態(tài)學(xué)變化

Control組腸黏膜絨毛完整，黏膜及黏膜下層無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)出血及潰瘍形成;I/R組腸壁變薄，腸黏膜絨毛短細(xì)，部分絨毛上皮脫落，黏膜下層及肌層水腫，固有層有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴出血、潰瘍形成;七葉皂苷鈉組腸絨毛損傷減輕。

3 討論

腸I/R損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中以氧自由基的損傷為最重要的發(fā)病環(huán)節(jié)[2]，小腸是I/R損傷時(shí)最易受累的器官之一。I/R時(shí)富含黃嘌呤氧化酶的腸上皮細(xì)胞將產(chǎn)生大量氧自由基，而腸組織富含不飽和脂肪酸，最易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而破壞腸黏膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損害及通透性增加[3]。MPO是中性粒細(xì)胞內(nèi)一種重要氧化酶，常用來(lái)表示組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。而激活的中性粒細(xì)胞釋放大量氧自由基、蛋白酶等毒性物質(zhì)，進(jìn)一步加重組織損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，I/R組大鼠血漿和腸黏膜MPO活性和脂質(zhì)過(guò)氧化物終產(chǎn)物MDA含量增加，而抗氧化酶SOD活性顯著降低，同時(shí)小腸病理?yè)p害嚴(yán)重，腸組織W/D和含水率均相應(yīng)升高。結(jié)果提示，中性粒細(xì)胞在腸組織中聚集、活化，氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化是腸I/R腸損傷的重要病理學(xué)機(jī)制。

二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)是存在于小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)高活性的結(jié)構(gòu)酶，是反映小腸黏膜結(jié)構(gòu)功能的較為理想的指標(biāo)[4]。腸I/R損傷后腸黏膜細(xì)胞壞死，釋放DAO進(jìn)入血液。因此血中DAO活性增高與腸細(xì)胞受損后細(xì)胞膜通透性增加及細(xì)胞壞死脫落相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸I/R損傷后血中DAO活性升高，腸組織DAO活性降低，并與腸組織MPO活性和MDA含量升高以及腸黏膜毛細(xì)血管通透性增高相一致。

七葉皂苷鈉是從歐洲七葉樹(shù)的干燥成熟果實(shí)(中藥娑羅子)中提取，具有明顯的消腫、抗炎、抗?jié)B出、增加靜脈張力及改善微循環(huán)的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物在缺血前、再灌前、再灌后30min給予七葉皂苷鈉后，血漿和腸黏膜MPO活性和MDA含量降低，SOD活性升高，同時(shí)反映腸損傷的血漿DAO活性明顯降低，而腸組織DAO活性相應(yīng)升高，腸損傷明顯減輕。提示七葉皂苷鈉對(duì)腸I/R腸過(guò)氧化損傷有一定的拮抗作用。分析其作用機(jī)制可能是通過(guò)減輕腸組織缺血缺氧，提高腸組織的抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕中性粒細(xì)胞在腸組織的聚集與活化而發(fā)揮作用。

[1]李 焱，王永剛，劉學(xué)源.β-七葉皂苷鈉的研究進(jìn)展[J].神經(jīng)病學(xué)與神經(jīng)康復(fù)學(xué)雜志，2009，6(2):147-150.

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