高原低氧習(xí)服大鼠紅細(xì)胞變形性的變化規(guī)律及其分子機(jī)制*

聶鴻靖，田云梅，張東祥，汪 海

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所軍事高原醫(yī)學(xué)研究室，天津 300050)

紅細(xì)胞有多種重要生理功能，其中紅細(xì)胞膜在維持其正常形態(tài)、物質(zhì)運(yùn)輸、變形性、膜抗原性、免疫功能等功能方面發(fā)揮著重要作用，紅細(xì)胞變形性是組織和器官血液灌注及供氧的決定因素，是完成體內(nèi)O2與CO2運(yùn)輸?shù)谋ＷC，紅細(xì)胞變形性降低會影響血液循環(huán)，導(dǎo)致微循環(huán)的有效灌注量減少，加重組織缺氧[1]。

以往研究表明，世居和移居久居人群的紅細(xì)胞變形性顯著高于對照組和移居暫居人群，認(rèn)為高原低氧使紅細(xì)胞的生成增加、更新加速、幼稚紅細(xì)胞的比例提高，從而改善了紅細(xì)胞群體的變形性，這是機(jī)體對高原低氧環(huán)境的一種適應(yīng)性改變[2]。據(jù)報(bào)道，進(jìn)入高原初期若能改善紅細(xì)胞的變形性，對急性高原病的防治將會起到積極作用。但有關(guān)低氧引起紅細(xì)胞變形性改變的機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)擬從紅細(xì)胞變形性、紅細(xì)胞的膜流動性、紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)表達(dá)、紅細(xì)胞膜ATP酶活性及胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度方面觀察高原低氧習(xí)服紅細(xì)胞變形性的變化規(guī)律，初步探索其分子機(jī)制，為尋找急性高原病的防治新措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

1，6-二苯基1 ，3，5-乙三烯(DPH)熒光探針 、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines，PE)、PC 、PS、SM的標(biāo)準(zhǔn)品均為 Sigma產(chǎn)品;APS、CHAPS、DTT、SDS、TEMED、Tris、Iodoacetamide、Acrylamide、N，N ‘ -Methylenebisacrylamide、Urea、Glycerol 、Glycine、Pharmalytes，pH 3～10、IPG Strip均為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品;BSA、DNase I、PMSF、RNase、Bromophenol blue、Acetone、Coomassie Brilliant Blue、Silver nitrate、Thiourea為Amresco公司產(chǎn)品;紅細(xì)胞膜ATP酶活性的測定試劑盒、紅細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度的測定試劑盒均為南京建成生物制品有限責(zé)任公司產(chǎn)品;其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物模型

健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，隨機(jī)分為3組(n=10):常氧對照組、急性低氧組和低氧習(xí)服組。急性低氧組大鼠在小型動物低壓艙內(nèi)模擬海拔高度8000m進(jìn)行低氧，8 h后下艙，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，心臟采血;低氧習(xí)服組大鼠在上述低壓艙內(nèi)模擬一定海拔高度進(jìn)行間斷低氧習(xí)服，在模擬海拔高度3000m間斷低氧習(xí)服2周，每天4h;然后在模擬海拔高度5000m間斷低氧習(xí)服2周，每天4h。于第29天同急性低氧組大鼠一起進(jìn)行急性低氧，下艙后，心臟采血處理同上;常氧對照組大鼠在常氧條件下飼養(yǎng)，心臟采血處理同上。

1.3 紅細(xì)胞變形性的測定

取20μl ACD 液抗 凝血液 加入 800μl的 15%PVP液中混勻，采用LG-B-190血細(xì)胞變形聚焦測試儀進(jìn)行紅細(xì)胞變形性的測定[2]。

1.4 紅細(xì)胞膜流動性的測定

取1 ml肝素抗凝血，離心除去血漿和灰白色血細(xì)胞層，加入154 mmol/L NaCl溶液將沉淀紅細(xì)胞懸浮，離心棄上清。然后按1∶10(V/V)加入預(yù)冷的低滲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4)，混勻后置 4℃30min，以 12000r/min 4℃離心10min，棄上清，將得到紅細(xì)胞膜樣品按文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行，采用日立F-4000熒光分光光度計(jì)檢測標(biāo)記于紅細(xì)胞膜內(nèi)的DPH熒光偏振度(P)，表示膜流動性。

1.5 紅細(xì)胞膜膽固醇和總磷脂含量的測定

取1 ml肝素抗凝血，離心除去血漿和灰白色血細(xì)胞層后取紅細(xì)胞液 200μl，加入雙蒸水 500μl，置4℃10min，然后加異丙醇 5.5 ml搖勻，置 4℃10min，然后置室溫1 h。加入三氯甲烷3.3 ml，置4℃10min，取出后置室溫1 h。3000r/min離心10min后取上清液，通氮?dú)鈱⑵浯蹈珊?，按文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行，紅細(xì)胞膜膽固醇的測定采用鄰苯二甲醛-醋酸-硫酸法，紅細(xì)胞膜總磷脂的測定采用化學(xué)定量法。

1.6 紅細(xì)胞膜磷脂成分PC、PS、PE、SM的測定

紅細(xì)胞膜磷脂的提取同1.5，加三氯甲烷-甲醇(2∶1，V/V)20μl于通氮?dú)獯蹈傻?EP 管內(nèi)，搖勻后，用毛細(xì)管吸取樣品30μg，按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行，采用津島CS-930型雙波長掃描儀測定紅細(xì)胞膜磷脂成分 PC 、PS、PE、SM 的含量，掃描條件:測定波長 λs650nm，λF475 nm，狹縫 6.7 mm×0.2 mm。

1.7 紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

將1.5取得的樣品重懸于300μl的裂解液(6 mol/L urea 、2 mol/L thiourea、4%CHAPS、40mmol/L Tris、60mmol/L DTT 、0.5%Pharmalytes 3-10，20μg/μl DNase I、5μg/μl RNase)中 ，混勻 ，室溫靜置2 h ，以4℃，12000r/min離心20min，取上清。蛋白質(zhì)定量后依據(jù)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行雙向電泳。凝膠圖像分析與質(zhì)譜技術(shù)鑒定依據(jù)文獻(xiàn)[6]。

1.8 紅細(xì)胞膜ATP酶活性、紅細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度的測定

取1 ml肝素抗凝血，采用南京建成生物制品有限責(zé)任公司試劑盒分別按說明書進(jìn)行操作[7]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性低氧及低氧習(xí)服對大鼠紅細(xì)胞變形性和膜脂流動性的影響

常氧對照組、急性低氧組和低氧習(xí)服組大鼠紅細(xì)胞變形性分別為0.51±0.05、0.42±0.01和0.52±0.09。急性低氧組大鼠紅細(xì)胞變形性低于常氧對照組(P＜0.05)，低氧習(xí)服組大鼠紅細(xì)胞變形性較急性低氧組大鼠紅細(xì)胞變形性增強(qiáng)(P＜0.05)，并接近于常氧對照組水平(圖1A)。

膜脂流動性用熒光偏振度表示，熒光偏振度數(shù)值愈高表示膜脂流動性愈低，反之亦然。常氧對照組、急性低氧組和低氧習(xí)服組大鼠紅細(xì)胞膜熒光偏振度分別為0.289±0.016、0.336±0.018和0.294±0.013。急性低氧組紅細(xì)胞膜熒光偏振度明顯高于常氧對照組(P＜0.01)，低氧習(xí)服組紅細(xì)胞膜熒光偏振度明顯低于急性低氧組(P＜0.01)，接近于常氧對照組的水平(圖1B)。

2.2 急性低氧及低氧習(xí)服對大鼠紅細(xì)胞膜膽固醇和總磷脂含量的影響

急性低氧組紅細(xì)胞膜膽固醇含量、紅細(xì)胞膜總磷脂含量、膜膽固醇/總磷脂的比值明顯低于常氧對照組(P＜0.01)，而低氧習(xí)服組這三項(xiàng)指標(biāo)明顯高于急性低氧組(P＜0.01)，并接近于常氧對照組的水平(表1)。

Fig.1 Effect of acute hypoxia andhypoxia acclimatization on erythrocyte deformability and fluorescence polarization

Tab.1 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on erythrocyte membrane cholesterin and total lipid(，n=10)

Tab.1 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on erythrocyte membrane cholesterin and total lipid(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs acute hypoxia

Group Cholesterin(mmol/g pro)Total phospholipid(mmol/g pro)Cholesterin/Total phospholipid Control 0.468±0.020 0.559±0.025 0.842±0.032 Acute hypoxia 0.412±0.064* 0.517±0.019** 0.801±0.026*Hypoxia acclimatization 0.472±0.014# 0.572±0.024## 0.833±0.029#

2.3 急性低氧及低氧習(xí)服對大鼠紅細(xì)胞膜磷脂各成分含量的影響

急性低氧組PS、SM 含量、SM/PC明顯高于常氧對照組(P＜0.01)，PC含量明顯低于常氧對照組(P＜0.01)，而低氧習(xí)服組PS、SM 含量、SM/PC低于或明顯低于急性低氧組(P＜0.05，P＜0.01)，并接近常氧對照組水平，PC含量明顯高于急性低氧組(P＜0.01)，并接近常氧對照組水平，三組之間PE含量的變化無明顯差別(表2)。

Tab.2 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on the components of erythrocyte membrane lipids(，n=10)

Tab.2 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on the components of erythrocyte membrane lipids(，n=10)

**P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs acute hypoxia

Group Phosphatidylserines(PS)(g/L)Phosphatidylethanolamines(PE)(g/L)Phosphatidylcholine(PC)(g/L)Sphingomyelin(SM)(g/L)SM/PC Control 0.379±0.065 0.431±0.055 0.609±0.022 0.151±0.030 0.247±0.045 Acute hypoxia 0.463±0.065** 0.471±0.052 0.548±0.036** 0.241±0.036** 0.440±0.054**Hypoxia acclimatization 0.383±0.061# 0.443±0.044 0.591±0.019## 0.168±0.035## 0.283±0.058##

2.4 急性低氧及低氧習(xí)服對大鼠紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)含量的影響

選取7個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，急性低氧后蛋白質(zhì)點(diǎn)1、3 、4、5表達(dá)降低(P ＜0.05)，蛋白質(zhì)點(diǎn) 2、6、7 表達(dá)無明顯改變;低氧習(xí)服后蛋白質(zhì)點(diǎn)1、3、4表達(dá)顯著降低(P ＜0.01)，蛋白質(zhì)點(diǎn)2、5、6、7表達(dá)顯著增高(P＜0.01，圖2);差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)、分子量和相對含量結(jié)果見表3;質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表4，分別是補(bǔ)體結(jié)合蛋白、水通道蛋白I、膜攻擊復(fù)合物抑制因子、脂質(zhì)移行酶、葡萄糖運(yùn)載體、氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶、依賴ATP的翻轉(zhuǎn)酶。

Fig.2 Enlarged 2-DEmaps of rat erythrocyte membrane.The numbers showed the protein spots which relative spot volume changed

Tab.3 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on the relative spot volume of erythrocyte membrane protein spots(，n=3)

Tab.3 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on the relative spot volume of erythrocyte membrane protein spots(，n=3)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs acute hypoxia

Spot pI MWt(kD)Relative spot volume(%)Control Acute hypoxia Hypoxia acclimatization 1 7.38 29.031 0.486±0.018 0.451±0.011* 0.204±0.016**##2 8.08 33.108 0.126±0.011 0.123±0.012 0.468±0.008**##3 6.05 18.697 0.482±0.016 0.447±0.011* 0.205±0.005**##4 7.72 18.471 0.326±0.006 0.309±0.008* 0.191±0.006**##5 4.43 31.983 0.421±0.012 0.391±0.011* 0.601±0.011**##6 5.96 38.323 0.428±0.022 0.419±0.024 0.817±0.019**##7 7.83 35.601 0.188±0.012 0.178±0.016 0.478±0.018**##

Tab.4 Identification result of mass spectrum of different proteins

2.5 急性低氧及低氧習(xí)服對大鼠紅細(xì)胞ATP酶活性、紅細(xì)胞Na+和Ca2+濃度的影響

急性低氧組紅細(xì)胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于常氧對照組(P＜0.01)，而低氧習(xí)服組這兩種酶活性均明顯高于急性低氧組(P＜0.01)，并接近于常氧對照組的水平(表5)。

急性低氧組紅細(xì)胞內(nèi)Na+濃度和Ca2+濃度明顯高于常氧對照組(P＜0.01)，低氧習(xí)服組這兩種離子濃度均明顯低于急性低氧組(P＜0.01)，并接近于常氧對照組的水平(表6)。

Tab.5 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on ATP enzyme activity of erythrocyte membrane(μmol/(mg pro?h)，，n=10)

Tab.5 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on ATP enzyme activity of erythrocyte membrane(μmol/(mg pro?h)，，n=10)

**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs acute hypoxia

Group Na+-K+-ATP enzyme Ca2+-Mg2+-ATP enzyme Control 17.032±0.891 18.346±0.287 Acute hypoxia 15.788±0.415**16.376±0.227**Hypoxia acclimatization 16.963±0.816##18.179±0.142##

Tab.6 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on ionic concentration of Na+and Ca2+in erythrocyte(μmol/g，，n=10)

Tab.6 Effect of acute hypoxia and hypoxia acclimatization on ionic concentration of Na+and Ca2+in erythrocyte(μmol/g，，n=10)

**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs acute hypoxia

Group Na+ Ca2+Control 34.170±2.389 4.610±1.077 Acute hypoxia 40.330±2.230**7.500±1.049**Hypoxia acclimatization 35.420±1.730##4.910±0.504##

3 討論

紅細(xì)胞變形性是保證微循環(huán)有效灌注和組織供氧的重要因素，紅細(xì)胞的膜流動性是影響紅細(xì)胞變形性的重要因素，膜流動性是指膜內(nèi)部脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性低氧使大鼠紅細(xì)胞變形性和紅細(xì)胞膜流動性均明顯降低，經(jīng)低氧習(xí)服后，變形性和膜流動性均有所改善，可見低氧習(xí)服對急性低氧致紅細(xì)胞變形性和膜流動性降低具有一定的改善作用，這提示，低氧使紅細(xì)胞變形性變化可能與紅細(xì)胞膜流動性的改變有密切關(guān)系[1]。

紅細(xì)胞膜中脂質(zhì)占42%，脂質(zhì)的變化與膜流動性關(guān)系密切，紅細(xì)胞膜上的膽固醇為紅細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)提供結(jié)構(gòu)骨架，可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動性。紅細(xì)胞膜膽固醇含量與磷脂有一定的比例，若膽固醇/磷脂(C/P)比值降低，則膜流動性降低，此時紅細(xì)胞變形性降低[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性低氧后紅細(xì)胞膜膽固醇含量、總磷脂含量、膽固醇/總磷脂的比值下降，經(jīng)低氧習(xí)服后這三項(xiàng)指標(biāo)有所恢復(fù)，接近于常氧對照組的水平，可見低氧習(xí)服對急性低氧致紅細(xì)胞膜膽固醇含量、總磷脂含量、膽固醇/總磷脂的比值降低具有一定改善作用，低氧習(xí)服后大鼠紅細(xì)胞膜流動性升高，變形性增強(qiáng)，從而有利于組織和器官供氧。

紅細(xì)胞膜外層脂類富含PC和SM，內(nèi)層脂類以PS和PE為主。膜磷脂的不對稱分布是維持紅細(xì)胞正常形態(tài)、良好的變形性、膜的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性低氧后紅細(xì)胞膜PS含量、SM 含量、SM/PC比值明顯升高，PC含量明顯下降，經(jīng)低氧習(xí)服后有所恢復(fù)，提示低氧習(xí)服對急性低氧致紅細(xì)胞膜磷脂成分的變化具有一定改善作用，紅細(xì)胞變形性增強(qiáng)可能與低氧習(xí)服引起的紅細(xì)胞膜磷脂各成分含量的變化有關(guān)，低氧習(xí)服對維持紅細(xì)胞的正常功能，保證組織和器官的供氧有重要作用。

近年國外高原醫(yī)學(xué)學(xué)者把蛋白質(zhì)組學(xué)概念及其相關(guān)的技術(shù)方法應(yīng)用到高原醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，目前主要集中于揭示高原低氧習(xí)服/適應(yīng)機(jī)制方面的研究[8-10]，但與高原低氧習(xí)服/適應(yīng)極為密切的紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了低氧大鼠紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)的初步探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與維持紅細(xì)胞膜正常不對稱性有關(guān)的氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶、依賴ATP的翻轉(zhuǎn)酶在急性低氧后表達(dá)雖變化不明顯，但在低氧習(xí)服后表達(dá)明顯增加，而脂質(zhì)移行酶在急性低氧后表達(dá)下降，在低氧習(xí)服后表達(dá)進(jìn)一步下降。其中氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⒅p層外層的PS和PE翻轉(zhuǎn)至內(nèi)層，對PC無此作用;依賴ATP的翻轉(zhuǎn)酶可將脂雙層內(nèi)層的PE、PS、PC翻轉(zhuǎn)至外層，與氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶作用正好相反，但速度慢;脂質(zhì)移行酶可促進(jìn)脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)。氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增加的結(jié)果促使PS和PE內(nèi)翻;依賴ATP的翻轉(zhuǎn)酶表達(dá)增加的結(jié)果促使PS、PE、PC外翻，但 PS、PE外翻的結(jié)果被氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶內(nèi)翻的作用所抵消，致PC增加;脂質(zhì)移行酶表達(dá)降低可能在一定程度上抑制了脂質(zhì)的翻轉(zhuǎn)，綜上這三種酶的作用使得低氧習(xí)服大鼠紅細(xì)胞膜磷脂成分發(fā)生變化，使得低氧習(xí)服后紅細(xì)胞變形性增強(qiáng)，從而保證組織和器官供氧。

另外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，低氧習(xí)服后，與紅細(xì)胞免疫功能有關(guān)的補(bǔ)體結(jié)合蛋白和膜攻擊復(fù)合物抑制因子表達(dá)下降，提示紅細(xì)胞的免疫功能下降;維持紅細(xì)胞內(nèi)外水平衡的水通道蛋白Ⅰ表達(dá)增加，提示水分子通過紅細(xì)胞膜的量增加，從而保護(hù)紅細(xì)胞不破溶;與紅細(xì)胞代謝有關(guān)的葡萄糖運(yùn)載體表達(dá)增加，提示葡萄糖通過紅細(xì)胞膜的量增加，紅細(xì)胞代謝增強(qiáng)。

紅細(xì)胞ATP酶的主動轉(zhuǎn)運(yùn)功能對紅細(xì)胞與外環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和保持離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。生理狀態(tài)下，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶基本功能是維持胞內(nèi)低Na+、低Ca2+的狀態(tài)。紅細(xì)胞的許多功能都依賴于胞內(nèi)外的離子濃度差，一旦這種濃度差減低，紅細(xì)胞就要受到功能性損傷，甚至引起死亡[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性低氧后紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降，經(jīng)低氧習(xí)服后有所恢復(fù)，可見低氧習(xí)服對急性低氧致大鼠紅細(xì)胞膜ATP酶活性的降低有一定改善作用。急性低氧時大鼠紅細(xì)胞ATP與血紅蛋白結(jié)合，使得胞漿ATP水平顯著下降，ATP的下降使得紅細(xì)胞膜ATPase能量供給不足，紅細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，難以維持其正常形態(tài)、良好的變形性以及功能，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞變形性下降;關(guān)于低氧習(xí)服引起紅細(xì)胞ATP水平恢復(fù)的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

Na+、Ca2+是紅細(xì)胞內(nèi)的重要陽離子，其含量的相對穩(wěn)定對維持紅細(xì)胞的正常形態(tài)和功能起重要作用。急性低氧時由于紅細(xì)胞ATP含量減少、鈉泵和鈣泵功能降低，紅細(xì)胞內(nèi)Na+和H2O潴留，Ca2+積聚，紅細(xì)胞腫脹，喪失其正常的形態(tài)，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形性降低[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性低氧后紅細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度升高，經(jīng)低氧習(xí)服后有所恢復(fù)，可見低氧習(xí)服對急性低氧致大鼠紅細(xì)胞膜內(nèi)鈉和鈣離子濃度變化有一定改善作用。國外學(xué)者認(rèn)為，紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高是其變形性降低的重要原因之一。低氧習(xí)服對急性低氧致大鼠紅細(xì)胞膜內(nèi)鈉和鈣離子濃度變化有一定保護(hù)作用，從而保證了紅細(xì)胞的變形性，保證了組織和器官的供氧。

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