塞來昔布對慢性低O2高CO2大鼠肺動脈高壓的影響及其機制研究*

曾海環(huán)，劉靈潔，黃羽平，謝于鵬，王良興

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

ZENG Hai-huan，LIU Ling-jie，HUANG Yu-ping，XIE Yu-peng，WANG Liang-xing

20世紀90年代中期對特異性COX-2抑制劑(SCOX-2I)的研究開始在國外興起，作為一種新興的抗炎藥物，據(jù)認為無傳統(tǒng)的非甾體內(nèi)抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS)引起的胃腸道和腎臟毒性而被廣泛應(yīng)用于治療各種急、慢性關(guān)節(jié)炎、軟組織風濕病、癌性疼痛、運動性損傷、痛經(jīng)及手術(shù)后疼痛等疾病。然而從 1999年第一代特異性COX-2抑制劑(SCOX-2I)塞來昔布(celecoxib)在美國上市以來，至今已發(fā)現(xiàn)存在許多問題，塞來昔布可減少健康受試者尿前列環(huán)素排泄，推測長期應(yīng)用可能增加栓塞事件[1]。此外，SCOX-2I還與心血管栓塞事件密切相關(guān)。目前認為，服用SCOX-2I出現(xiàn)血栓可能是此類藥物降低了前列環(huán)素(PGI2)的生成，而對血栓素A2(TXA2)不影響，從而導致血栓素與前列環(huán)素比值失衡。而血栓素和前列環(huán)素平衡失調(diào)與肺動脈高壓的形成有著密切的關(guān)系[2]。因此我們設(shè)想慢性肺心病患者合并有上述疾病長期服用SCOX-2I是否安全呢?本實驗擬采用慢性低O2高CO2肺動脈高壓大鼠模型，觀察塞來昔布對肺動脈高壓肺血管重建的影響，探討臨床上慢性肺心病患者使用塞來昔布的安全性。

1 材料與方法

1.1 動物模型復(fù)制及分組

二級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體重180-220g(由本院實驗動物中心提供)，隨機分為3組(n=10):(1)正常對照組(A組):作為常壓氧下的對照;(2)慢性低O2高CO2組(B組)置于常壓低氧高二氧化碳艙內(nèi)，使O2濃度維持在8.5%-11%，CO2濃度維持在5.0%-6.5%。艙內(nèi)水蒸氣用無水CaCL2吸收，每天 8 h(8:00-16:00)，每周6 d，連續(xù) 4周;(3)慢性低O2高CO2四周+塞來昔布用藥組(C組)，每次低O2高CO2前予塞來昔布(0.5 mg/(kg?d)灌胃，其它條件同B組。

1.2 肺動脈和頸動脈平均壓的測定

動物飼養(yǎng)4周后，于次日稱重，用戊巴比妥鈉(35-50mg/kg ip)麻醉，仰臥固定，行頸正中切口，分離右頸外靜脈和左頸總動脈，采用右心導管法測量大鼠肺動脈壓力。將聚乙烯塑料導管從右頸外靜脈插入右心室、肺動脈，導管另一端通過YL-4型壓力傳感器與SJ-42型四道生理記錄儀相連肺動脈壓力波，計算肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)。頸總動脈插管，連接YL-3型壓力傳感器通過SJ-42型四道生理記錄儀測頸動脈平均壓(mean carotid artery pressure ，mCAP)。

1.3 測定右心室/左室+室間隔重量比

沿房室環(huán)去除心房，沿室間隔邊緣剪下右心室，濾紙吸干后用電子天平分別稱取右室(right ventricle，RV)和左室+室間隔(left ventricle plus septum，LV+S)的重量，以RV/(LV+S)重量比來反映右心室重量的變化。

1.4 光鏡標本制作及觀察

放血處死大鼠，取右下肺組織，4%多聚甲醛固定，取固定后的肺，左肺門水平橫切，石蠟包埋、切片，厚度5μm，HE染色加Weigirt法彈力纖維染色，每只大鼠選1張肺組織切片，每張切片隨機選取直徑(50～200)μm肺細小動脈各5支，Image-Pro Plus 5.1軟件(Media Cybemetics公司)測定平均血管總面積(外彈力板以內(nèi))、血管腔面積(內(nèi)膜表面以內(nèi))以計算相對比值肺細小動脈管壁面積/管總面積(WT/TA)，并測定肺細小動脈管壁厚度(PAMT)。

1.5 電鏡標本制作及觀察

放血處死大鼠，取右肺門組織，水平橫切取1 mm×1mm×1 mm大小組織，用2.5%戊二醛作前固定，1%鋨酸作后固定，常規(guī)方法處理，半薄切片定位，LKB-2088型超薄切片機切片，常規(guī)染色，HITACHI-7501SS型透射電鏡觀察并拍照。

1.6 血漿及肺組織TXB2、6-keto-PGF1α含量測定

由于TXA2和PGI2的不穩(wěn)定性，故國內(nèi)外以測定TXB2、6-keto-PGF1α作為判斷其濃度的指標。分別按TXB2和PGI2放免藥盒操作(由北京華英生物技術(shù)研術(shù)研究所提供)

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mPAP、W A/TA、PAMT和mCAP的比較

慢性低O2高CO2組mPAP顯著高于對照組，塞來昔布組mPAP顯著高于慢性低O2高CO2組;三組間mCAP比較差異無顯著性。光鏡下慢性低O2高CO2組與對照組相比，肺細小動脈管壁面積/管總面積(WA/TA)和肺細小動脈中膜厚度(PAMT)均顯著增高;塞來昔布組WA/TA和PAMT顯著高于慢性低O2高CO2組(表1)。

Tab.1 Changes of mPAP，mCAP，WA/TA，RV/(LV+S)and PAMT in three groups(，n=10)

Tab.1 Changes of mPAP，mCAP，WA/TA，RV/(LV+S)and PAMT in three groups(，n=10)

mPAP:Mean pulmonary arteria pressure;mCAP:Mean carotid arteria pressure;WA/TA:Vessel wall area/total area;PAMT:Pulmonary arteriole medial thickness;RV:Right ventricle;LV:Left ventricle;S:Septum 1 mmHg=0.133 kPa**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) WA/TA PAMT(μm) RV/(LV+S)Control 10.55±0.73 128.12±2.44 0.38±0.10 17.37±1.44 0.20±0.02 Hypoxic hypercapnic 18.35±0.63** 129.80±2.59 0.62±0.09** 31.75±1.37** 0.27±0.03**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 22.53±1.23## 130.10±3.25 0.70±0.09## 36.64±1.88## 0.29±0.05##

2.2 慢性低O2高CO2組和塞來昔布組對大鼠肺細小動脈顯微結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下，正常對照組肺細小動脈內(nèi)彈力板自然彎曲，平滑肌層未見明顯增厚，管壁均勻一致。而慢性低O2高CO2組及塞來昔布組，中膜平滑肌細胞增生，管壁增厚。

2.3 慢性低O2高CO2組和塞來昔布組對大鼠肺細小動脈超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡下，正常對照組大鼠肺細小動脈內(nèi)皮細胞扁平，中膜有1～2層平滑肌細胞，平滑肌細胞之間有散在的膠原纖維，外膜為疏松的結(jié)締組織，有少量成纖維細胞及膠原細胞。慢性低O2高CO2組大鼠肺細小動脈內(nèi)皮細胞吞飲小泡增多，血管壁增厚，中膜平滑肌細胞增生，纖維細胞增多，膠原纖維密集，管腔明顯狹窄，肺泡II型上皮細胞微絨毛脫落，板層小體空泡狀(圖1、2);塞來昔布組中膜平滑肌細胞增大、增多，胞漿肌絲豐富，平滑肌細胞間隙增寬，肺泡隔膠原纖維增生明顯(圖3、4)。

Fig.2 Fibrocyte-cytosis in hypoxic hypercapnia group(electron microscopy×12 k)

Fig.3 Augmentation of smoothmuscle cell，abundance of myofilament in pulmonary arterioles in hypoxic hypocapnia+celecoxib group(electron microscopy×25k)

Fig.4 Collagen fiber of pulmonary alveolus saeptum were significantly accrementition in hypoxic hypocapnia+celecoxib group(electron microscopy×20k)

2.4 各組大鼠血漿、肺勻漿TXB2、6-keto-PGF1α含量及TXB2/6-keto-PGF1α的比較

與對照組相比，慢性低O2高CO2組血漿和肺勻漿TXB2濃度、TXB2/6-keto-PGF1α比值顯著增高，6-keto-PGF1α濃度顯著下降;塞來昔布組與慢性低O2高CO2組相比血漿和肺勻漿6-keto-PGF1α顯著降低，TXB2濃度無明顯改變，TXB2/6-keto-PGF1α比值顯著增高(表2、3)。

3 討論

花生四烯酸是膜磷脂的正常組成成分，經(jīng)環(huán)氧酶(COX)代謝為不穩(wěn)定的前列腺素內(nèi)過氧化物PGG2和PGH2，后者被一種異構(gòu)酶處理成均有生理活性的前列環(huán)素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)、前列腺素F2a(PGF2a)、前列腺素E2(PGE2)等。血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)平衡失調(diào)與肺動脈高壓的形成有著密切的關(guān)系[1]。環(huán)氧酶有兩種同功酶——COX-1、COX-2。COX-1呈構(gòu)成性表達，介導血栓素A2的合成，血栓素A2激活血小板并促使血小板的聚集，具有收縮肺動脈、促進平滑肌細胞和纖維母細胞增殖的作用;COX-2呈誘導性表達，介導前列環(huán)素的合成，前列腺素的作用與血栓素A2正相反。

Tab.2 Content of TXB2，6-keto-PGF1αandTXB2/6-keto-PGF1αin plasma in four grous(，n=10)

Tab.2 Content of TXB2，6-keto-PGF1αandTXB2/6-keto-PGF1αin plasma in four grous(，n=10)

**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group TXB2(pg/ml) 6-keto-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-keto-PGF1α Control 205.08±7.26 145.61±5.45 1.42±0.28 Hypoxic hypercapnic 348.30±13.25** 124.00±5.20** 2.75±0.52**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 350.53±13.09 112.50±5.21## 3.12±0.69##

Tab.3 Content of TXB2，6-keto-PGF1αand TXB2/6-keto-PGF1αin lung in four groups(，n=10)

Tab.3 Content of TXB2，6-keto-PGF1αand TXB2/6-keto-PGF1αin lung in four groups(，n=10)

*P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group TXB2(pg/ml) 6-keto-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-keto-PGF1α Control 32.20±6.52 70.25±6.27 0.45±0.05 Hypoxic hypercapnic 57.12±5.87** 55.15±3.48** 1.02±0.08**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 58.55±6.12## 42.23±3.10## 1.39±0.11##

目前通過FDA批準的COX-2選擇性抑制劑有兩個，塞來昔布和羅非昔布。2004年9月30日，羅非昔布從全球市場撤回，其原因是懷疑它會增加服用者心血管事件的發(fā)生率。支持這一論斷的是VIGOR(vioxx gastrointestinal outcomes research study)實驗，此項研究中患者沒有使用阿司匹林，結(jié)果50mg/d羅非昔布治療組與萘普生治療組相比，心血管事件的發(fā)生率顯著增加[3]。也有報道系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者服用塞來昔布兩天后出現(xiàn)呼吸困難可能是因為肺栓塞的原因[4]。目前認為，由于SCOX-2I對COX-2作用比COX-1大100倍，服用SCOX-2I出現(xiàn)血栓可能是此類藥物降低了前列環(huán)素的生成，而對血栓素不影響，從而導致血栓素與前列環(huán)素比值失衡。研究發(fā)現(xiàn)COX-2對肺動脈平滑肌細胞在缺氧中的反應(yīng)起到正調(diào)節(jié)作用，可能由此保護肺組織。Fredenburgh等[5]通過對野生株和COX-2基因剔除株大鼠對缺氧的反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2因子的缺失將引起慢性缺氧后肺血管重建，增強平滑肌細胞的收縮性，加劇肺動脈高壓。Cathcart等[6]也發(fā)現(xiàn)，COX-2有弱化缺氧誘導的肺動脈高壓和血管內(nèi)血栓形成的作用。本人先前的研究也表明COX-2表達與低氧高二氧化碳性肺動脈高壓呈負相關(guān)。提示過度抑制COX-2，可能加重肺動脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重建[7]。

本實驗發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2大鼠與正常組相比較肺動脈壓力、血漿和肺勻漿TXB2/6-keto-PGF1α明顯升高。慢性低O2高CO2+celebrex組，肺動脈壓力高于慢性低O2高CO2組，血漿和肺勻漿6-keto-PGF1α顯著降低，TXB2/6-keto-PGF1α比值顯著增高。塞來昔布可能過度抑制COX-2活性，導致PGI2合成減少，其舒血管作用、保護內(nèi)皮及抗血小板聚集作用減低，而對TXA2影響不明顯，本身在低氧環(huán)境下，內(nèi)皮受損，血小板激活聚集，有肺小動脈血栓形成傾向。肺動脈血栓形成能加重已有的肺動脈高壓和右心負荷，對肺心病的發(fā)生發(fā)展起一定促進作用。但本實驗電鏡觀察未見肺微血栓形成，這可能與肺組織取材、塞來昔布使用的劑量不足和給藥的時間不夠長有關(guān)，需要進一步的研究。

[1]Tseng C C，WolfeM M.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].Med Clin North Am，2000，84(5):1329-1344.

[2]Freitas C F，F(xiàn)aro R，Dragosavac D，et al.Role of endothelin-1 and thromboxane A2 in the pulmonary hypertension induced by heparin-protamine interaction in anesthetized dogs[J].J Cardiovasc Pharmacol，2004，43(1):106-112.

[3]Bombardier C，Laine L，Reicin A，et al.Comparison of upper gastrointestinal toxicity of rofecoxib and naproxen in patientswith rheumatoid arthritis.VIGOR Study Group[J].N Engl J Med，2000，343(21):1520-1528.

[4]Crofford L J，Oates J C，McCune W J，et al.Thrombosis in patients with connective tissue diseases treated with specific cyclooxygenase 2 inhibitors[J].Arthritis Rheum，2000，43(8):1891-1896.

[5]Fredenburgh L E，Liang O D，Macias A A，et al.Absence of cyclooxygenase-2 exacerbates hypoxia-induced pulmonary hypertension an enhances contractility of vascular smooth muscle cells[J].Circulation，2008，117(16):2114-2122.

[6]Cathcart M C，Tamosiuniene R，Chen G，et al.Cyclooxygenasez-linked attenuation of hypoxia-induced pulmonary hypertension and intravascular thrombosis[J].Pharmacol Exp Ther，2008，326(1):51-58.

[7]曾海環(huán)，王良興，胡 穎，等.低O2高CO2對肺動脈環(huán)氧酶-2基因表達的影響[J].中國應(yīng)用生理學雜志，2006，22(1):114-116.