纖維母細胞生長因子3對前丘腦γ-氨基丁酸能抑制性軸突的排斥作用

黃 紅，余舒揚，張蔚云，肖 俐，徐貞剛，劉 芳

丘腦是機體重要的感覺傳導接替站，來自全身的感覺傳導通路(除嗅覺外)，均在丘腦內(nèi)更換神經(jīng)元，并通過丘腦皮質(zhì)軸突投射到大腦皮質(zhì)[1]。丘腦含有兩類主要的神經(jīng)元群：抑制性的γ-氨基丁酸能(γ-aminobutyric acid, GABA)神經(jīng)元和位于后丘腦的興奮性谷氨酸能神經(jīng)元[2]。其中，前丘腦GABA抑制性神經(jīng)元伸出的軸突對興奮性谷氨酸能神經(jīng)元起著重要的調(diào)節(jié)作用。例如，精神分裂癥、阿爾茨海默病的發(fā)生，均與前丘腦GABA抑制中間神經(jīng)元的功能缺陷有關(guān)[3-5]。然而，與大量關(guān)于大腦皮層抑制作用發(fā)展的研究相比，丘腦抑制作用的形成與成熟機制尚不清楚。

纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factors, FGFs)構(gòu)成了一個多肽生長因子的大家族。在脊椎動物中， FGFs被化分為7大亞族[6]。研究[7]表明，在早期發(fā)育中 FGF7亞族的FGF3和FGF10調(diào)節(jié)下丘腦正中隆起基底細胞的分化，但在下丘腦發(fā)育后期， FGF3和FGF10 能作為化學趨化因子指導下丘腦軸突抵達正中隆起[8]。這提示表達在下丘腦FGF3也許是另一類對丘腦具有化學導向作用的分子，引導著鄰近前丘腦GABA抑制性神經(jīng)元軸突的生長。

1 材料與方法

1.1 主要試劑FGF3(美國R&D公司)；SU5402(德國Calbiochem公司)；鼠尾膠原蛋白I型(美國R&D公司)；Affigel beads (美國Pharmacia Biotech公司)；DMEM、M199、胎牛血清(美國Gibco公司)；中性蛋白酶(美國Thermo Fisher公司)；anti-FGF3(美國Ablonal公司，1 ∶200)； anti-TUJ1(英國Abcam公司，1 ∶800)、anti-PV(北京博奧森公司，1 ∶400)；二抗Alexa Fluor 488、568(美國ThermoFisher公司，1 ∶800)；親脂性羰花青染料(lipophilic carbocyanine dye，DiI)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 三維組織培養(yǎng)將受精種雞蛋(江西省種雞場)孵育在溫度為39℃、濕度為60%的培養(yǎng)箱中5～6 d。中性蛋白酶(20 min, 1 mg/ml)消化分離神經(jīng)外胚層與中胚層。分離的神經(jīng)外胚層組織塊將依據(jù)已發(fā)表的技術(shù)和方法[8]培養(yǎng)在膠原蛋白凝膠中，48 h后檢測觀察。

1.3 免疫熒光胚胎(n≥6)和組織塊(n≥6)的免疫組織化學分析是依據(jù)已發(fā)表技術(shù)在冰凍切片或整體組織塊上進行[7]。樣本滴加Ⅰ抗(封閉液中)后，室溫靜置1 h或者4 ℃ 過夜。PBST 洗滌3次，加Ⅱ抗室溫孵育2 h，PBST(PBS+0.1% Triton X-100)洗滌3次,封片，Olympus ix70倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 DiI示蹤親脂性羰花青染料DiI是神經(jīng)生物實驗中常用的熒光示蹤劑。分離E6雞胚大腦，將DiI(5 mg/ml無水乙醇)注入后丘腦，固定于4%多聚甲醛中1個月。PBS充分清洗后，顯微追蹤前丘腦GABA抑制性神經(jīng)纖維的生長。

2 結(jié)果

2.1 FGF3與PV在間腦的表達及定位首先使用免疫熒光法確定FGF3在雞胚間腦(丘腦和下丘腦)的表達。在E5， FGF3 的表達擴展到下丘腦的背側(cè)區(qū)域(圖1B)。PV是前丘腦成熟GABA神經(jīng)元標志性基因。E5前丘腦橫切面(圖1A)的免疫熒光結(jié)果顯示，PV在前丘腦有著廣泛的表達(圖1C)。

2.2 下丘腦源FGF3對前丘腦GABA軸突的導向作用為檢測GABA神經(jīng)纖維進入丘腦的時期，本研究將DiI注入E6雞胚后丘腦，并置于4%PFA固定四周。熒光顯示：已有少量前丘腦GABA抑制性神經(jīng)纖維平行延伸并在丘腦背側(cè)匯合(圖2A)，說明在E6時期前丘腦GABA抑制性神經(jīng)纖維已進入丘腦。

為了驗證下丘腦源的FGF3的軸突導向功能，本研究進行了三維組織共同培養(yǎng)實驗。間腦不同區(qū)域組織塊被解剖出來，并放入三維膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)48 h(圖1D)。將E5前丘腦組織塊單獨培養(yǎng)或與PBS珠子共培養(yǎng)時，在膠原蛋白凝膠中幾乎沒有觀察到神經(jīng)纖維長出組織塊(圖2B、2C)。當前丘腦組織塊與下丘腦組織塊共培養(yǎng)時，研究結(jié)果顯示，下丘腦組織塊排斥前丘腦神經(jīng)軸突：軸突伸出凝膠并向遠離下丘腦組織塊的方向生長(圖2D、2G)。免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)GF3 和PV分別在下丘腦和前丘腦組織塊表達，表明組織塊解剖的正確性(圖2E、2F)。TUJ1抗體可識別class III-tubulin微管蛋白，因此能標記正在發(fā)育的前體神經(jīng)細胞及纖維。使用TUJ1與PV抗體共同標記前丘腦軸突顯示，被下丘腦排斥的TUJ1軸突中含有大量前丘腦GABA抑制性軸突(圖2H、2I)。

圖1 FGF3、PV在間腦的表達與組織塊分離示意圖A：雞胚間腦結(jié)構(gòu)示意圖；虛線：縱切線；B：FGF3在下丘腦的表達；C：PV在E5雞胚前丘腦的表達；D：雞胚間腦組織塊分離示意圖；Tel：端腦；T：丘腦；PT：前丘腦；HT：下丘腦；B、C：×200

為檢測下丘腦源的FGF3是否參與了前丘腦GABA神經(jīng)元軸突的路徑選擇，采用FGF3的珠子與前丘腦組織塊共培養(yǎng)實驗。與單獨培養(yǎng)的前丘腦組織塊相比(圖2B)，F(xiàn)GF3珠子(300 ng/ml)能顯著促進前丘腦TUJ1+軸突在凝膠中的生長[n=6，(4.33±1.21)vs(38.00±6.72)軸突束，t=12.072，P<0.01](圖3A)；并且，前丘腦軸突的數(shù)量在近側(cè)(FGF3側(cè))明顯少于遠側(cè)(遠離FGF3側(cè))[n=6，(5.50±1.05)vs(32.50±7.31)軸突束，t=8.950，P<0.01]。并且，在這些被排斥的軸突中，含有大量PV+ GABA神經(jīng)纖維(圖3B)。為了確定FGF信號是否參與前丘腦GABA抑制性神經(jīng)纖維的引導作用，前丘腦組織塊暴露于FGFR抑制劑SU5402(20 μmol/L)之中。培養(yǎng)基中含有SU5402時，F(xiàn)GF3珠子無法引導前丘腦GABA神經(jīng)纖維的生長方向；膠原凝膠中只有少量前丘腦軸突(圖3C)。

圖2 下丘腦組織塊對前丘腦GABA抑制性軸突生長具有導向作用A：DiI示蹤結(jié)果；B：前丘腦組織塊單獨培養(yǎng)；C：前丘腦組織塊與PBS珠子共培養(yǎng)；D：前丘腦與下丘腦組織塊共培養(yǎng)；E：FGF3在下丘腦組織塊的表達；F：PV在前丘腦組織塊的表達；G：前丘腦與下丘腦組織塊共培養(yǎng)； H：共培養(yǎng)中前丘腦GABA軸突被PV標記；I：共培養(yǎng)中前丘腦GABA軸突被TUJ1標記；A、B、C、D、G：× 40

圖3 FGF3對前丘腦GABA軸突生長的影響A：FGF3珠子與前丘腦組織塊共培養(yǎng)；B：PV+的前丘腦GABA軸突標記；C: FGF3珠子、前丘腦組織塊、SU5402的共培養(yǎng)；A、C：×40

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由許多神經(jīng)細胞組成的，這些神經(jīng)細胞通過神經(jīng)纖維形成的功能回路對建立正常、有序的中樞系統(tǒng)是極為重要的。在軸突生長過程中，軸突頂端的生長錐能檢測到周圍環(huán)境中的導向因子；導向因子通過吸引或排斥軸突的方式幫助軸突找到通往目標的正確路途[9]。研究[10]表明，幾類組織形態(tài)發(fā)生分子，如Hhs、骨形態(tài)發(fā)生因子(BMPs)、Wnts和FGFs被報道是遠程軸突導向因子。組織形態(tài)發(fā)生分子是一種可擴散的蛋白質(zhì)，通過產(chǎn)生長程濃度梯度來提供模式信息。這些形態(tài)發(fā)生的模式化功能始于發(fā)育的早期階段，因此有理由推測，在胚胎發(fā)育后期，形態(tài)發(fā)生分子的殘存梯度可為后期神經(jīng)元軸突的導向提供方向信息[10]。在間腦內(nèi)，F(xiàn)GF3與FGF8協(xié)同作用，指導前丘腦的結(jié)構(gòu)雛形的形成；然而，對FGF3和FGF8在丘腦發(fā)育后期的軸突導向作用卻不包括在這些研究中[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，在E5前丘腦的新生軸突延伸過程中，F(xiàn)GF3的表達廣泛存在于下丘腦中。在下丘腦，F(xiàn)GF10也有表達，但FGF10只表達在腹側(cè)的正中隆起，離丘腦有較遠的距離[8]；而FGF3在發(fā)育后期，在下丘腦背側(cè)有著較為廣泛的表達，距離丘腦較近。這些都提示FGF3也可能是下丘腦中的一種長程擴散性軸突趨化信號，指引著鄰近前丘腦GABA纖維的路徑選擇。為了進一步了解GABA抑制性神經(jīng)纖維的走向，使用DiI體外跟蹤GABA抑制性神經(jīng)纖維的生長。DiI是一種紅色晶體，熒光強而穩(wěn)定,可沿脂質(zhì)膜擴散，有良好的軸突特異性。實驗結(jié)果顯示，在E6，已有少量前丘腦纖維進入了(后)丘腦。因此，選擇E5雞胚間腦組織塊，進行三維凝膠共培養(yǎng)實驗。三維凝膠神經(jīng)組織培養(yǎng)能最大程度模擬神經(jīng)組織在體內(nèi)生長的立體三維環(huán)境，但又能避免體內(nèi)復雜因素的制約，是目前神經(jīng)生物學常用實驗方法。有研究[13-14]表明，當環(huán)境中沒有軸突導向因子時，大部分軸突不會向組織塊外生長，而是圍繞著組織塊邊緣生長；但是，當環(huán)境中存在導向因子時，軸突才會向組織塊外生長，表現(xiàn)為被吸引或被排斥。本研究結(jié)果顯示下丘腦組織塊對前丘腦神經(jīng)纖維有著化學排斥作用；而來自下丘腦的FGF3能模擬下丘腦組織塊的功能，可刺激前丘腦軸突在三維凝膠中的生長，并指導相鄰的前丘腦GABA軸突向后丘腦的方向延伸，構(gòu)成有效的大腦抑制環(huán)路的一部分。在所有被排斥的軸突中，有部分軸突并不是前丘腦PV+的神經(jīng)纖維，這說明FGF3也許對丘腦的另外一種重要神經(jīng)纖維(丘腦皮質(zhì)軸突，TCAs)也具有導向作用：排斥TCAs進入下丘腦，幫助TCAs轉(zhuǎn)彎進入內(nèi)囊，從而投射大腦皮層。同時，通過抑制FGF通路的分析，揭示了FGF3對前丘腦GABA軸突發(fā)育的直接作用。這些結(jié)果說明，來源于下丘腦的FGF3在前丘腦GABA軸突導向中不可或缺的作用；下丘腦源的FGF3排斥前丘腦軸突向后丘腦延伸以調(diào)節(jié)興奮性谷氨酸能神經(jīng)元的功能。前丘腦GABA神經(jīng)元功能的失調(diào)已證實與阿爾茨海默病、癲癇、精神分裂及失眠等疾病相關(guān)，因此，F(xiàn)GF3對前丘腦GABA抑制性軸突的導向作用是理解丘腦內(nèi)抑制性神經(jīng)網(wǎng)絡形成機制的基礎(chǔ)，并將可能進一步解決此區(qū)域神經(jīng)損傷與再生等重要臨床問題，具有潛在的應用價值。