微柱離心結(jié)合雙波長考馬斯亮藍法/酶標儀法測定牛血清白蛋白脂質(zhì)體的包封率Δ

侯冬枝，梁曉暉，趙世洪，劉長科，平其能，劉軍（1.廣東藥學院，廣州市 510006；.中國藥科大學，南京市 10009；.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，南京市 10011）

脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)、多肽類藥物載體，可避免其過早被生物酶降解，增加藥物的穩(wěn)定性，國內(nèi)、外學者已將其廣泛應(yīng)用到如胰島素、白細胞介素等生物活性大分子藥物的研究中[1，2]。筆者利用逆相蒸發(fā)法將牛血清白蛋白（BSA）包封于脂質(zhì)體中，以增加其穩(wěn)定性。為檢測該脂質(zhì)體的包封率，筆者將葡聚糖凝膠DEAE-Sephadex A50微柱離心與雙波長考馬斯亮藍法/酶標儀法結(jié)合，建立了可以用于BSA脂質(zhì)體包封率測定中對痕量蛋白質(zhì)檢測的方法，所需樣品量僅為100 μL，一次即可進行較大量樣本的檢測，且操作快速、簡單、重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BS214D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)公司）；550酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

BSA脂質(zhì)體（批號：20061022，BSA含量：800 ng·mL－1）和空白脂質(zhì)體（批號：20061011）均由中國藥科大學藥劑學平其能教授實驗室自制；大豆磷脂（以下簡稱磷脂，上海太偉藥業(yè)有限公司，注射級）；考馬斯亮藍（美國Amresco公司，G-250型）；BSA（南京生興科技有限公司，含量：≥98%）；葡聚糖凝膠DEAE-Sephadex A50（美國Pharmcia公司）；膽固醇、95%乙醇、濃磷酸、乙醚、正己烷等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 空白脂質(zhì)體和BSA脂質(zhì)體的制備

采用逆相蒸發(fā)法制備空白脂質(zhì)體和BSA脂質(zhì)體。具體如下：稱取處方量磷脂、膽固醇和吐溫-80置于茄形瓶中，加入適量混合溶劑（乙醚-正己烷＝10∶1），待膜材溶解后，濾膜過濾，注射器注入BSA水溶液適量，短時超聲使成乳液后，置于0℃冰水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至膠態(tài)后，再繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至得到BSA脂質(zhì)體混懸液。最終制得樣品中的BSA含量為800 ng·mL－1。

空白脂質(zhì)體制備方法同上，只缺少注入BSA水溶液的步驟。

2.2 染料的制備

將100 mg考馬斯亮藍溶解在50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL的濃磷酸（85%，W/V），最后加蒸餾水至1000 mL，過濾，冷藏避光保存。

2.3 雙波長考馬斯亮藍法/酶標儀法含量測定方法的建立

2.3.1 BSA樣品液與染料體積比的確定。在潔凈小離心管中精密加入以純凈水溶解制備的BSA樣品液，使其濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL－1，再加入“2.2”項下制備的染料，使樣品與染料體積比分別為1∶1、1∶3、1∶4，輕輕振搖均勻，取出200 μL置于酶標板中，反應(yīng)10 min后，以595、450 nm作為檢測波長測定吸光度，以A595/A450值對BSA濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程的相關(guān)系數(shù)分別為0.9856、0.9992、0.9980，表明BSA樣品液與染料體積比為1∶3時，線性相關(guān)性較好，因此本試驗中選擇樣品液與染料體積比為1∶3。

2.3.2 反應(yīng)時間的確定。在潔凈小離心管中精密加入4 μg·mL－1BSA溶液100 μL，再加入300 μL染料，輕輕振搖，取200 μL置于酶標板中，以595、450 nm作為檢測波長，分別于反應(yīng)2.5、5、10、20、30、40、50、60 min后測定吸光度，計算A595/A450。測定結(jié)果見圖1。

圖1 吸光度值-反應(yīng)時間曲線Fig 1 Absorbance-reaction time curves

圖1結(jié)果表明，反應(yīng)時間在10 min以前，BSA與染料未反應(yīng)完全，30 min以后，體系不穩(wěn)定，明顯褪色，因此反應(yīng)時間應(yīng)控制在10～30 min之間，本研究將反應(yīng)時間選定為10 min。

2.3.3 測定方法的確定。根據(jù)上述試驗，最終確定的測定方法為：在離心管中精密加入100 μL待測樣品，再加入300 μL染料，輕輕振搖，取200 μL置于酶標板中，以595、450 nm作為檢測波長，反應(yīng)10 min后測定吸光度。

2.3.4 標準曲線的繪制。制備0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL－1系列濃度待測樣品，按照“2.3.3”項下方法進行操作，以A595/A450值對BSA濃度（c）進行線性回歸，得標準曲線方程為：A595/A450＝0.1168c+0.7791（r＝0.9992）。結(jié)果表明BSA檢測濃度線性范圍為0.25～32 μg·mL－1。

2.3.5 方法回收率考察。在離心管中分別精密加入0.25、4、32 μg·mL－1的待測樣品各4份，按照“2.3.3”項下方法進行操作，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.56%，RSD＝1.52%，表明方法回收率良好，詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.3.6 方法精密度試驗。在離心管中分別精密加入0.25、4、32 μg·mL－1的待測樣品各4份，按精密度試驗方法操作并計算，結(jié)果各濃度組RSD分別為2.73%、0.95%、1.62%。

2.4 BSA脂質(zhì)體包封率的測定

2.4.1 DEAE-Sephadex A50微柱離心法。（1）凝膠的活化處理。稱取少許DEAE-Sephadex A50顆粒于水中浸泡，并在攪拌下加入0.0175 mol·L－1、pH6.3 磷酸鹽緩沖液1000 mL，室溫放置過夜，第2天用同一緩沖液洗3～4次，傾出上層較小顆粒后，進行裝柱、平衡。（2）微柱離心分離步驟。于自制的微型離心柱中加入上述活化處理后的DEAE-Sephadex A50至5 mL體積處，將此柱置于塑料離心管中，1500 r·min－1離心3 min除水，準備上樣。精密吸取0.2 mL BSA脂質(zhì)體混懸液上柱，500 r·min－1離心5 min。加水0.3 mL，1500 r·min－1離心8 min，收集離心液。

2.4.2 DEAE-Sephadex A50微柱離心法柱系統(tǒng)的考察。（1）微柱對空白脂質(zhì)體的回收率。為考察自制微柱對脂質(zhì)體是否有吸附，以空白脂質(zhì)體進行下述試驗：微柱離心除去水分，精密吸取0.2 mL空白脂質(zhì)體，上柱4份，按照“2.3.5”項下方法操作，收集離心液；另取0.2 mL空白脂質(zhì)體4份，加水0.3 mL；分別將離心液及空白脂質(zhì)體置于10 mL容量瓶中，用混合溶劑（乙醚-異丙醇-水＝1∶2∶2）定容至刻度，于267 nm波長下測定吸光度。按照下式計算微柱對空白脂質(zhì)體的回收率：回收率（%）＝A離心液/A脂質(zhì)體×100%（A離心液為上柱離心處理后得到液體的吸光度值，A脂質(zhì)體為空白脂質(zhì)體的吸光度值）。結(jié)果，平均回收率為97.78%（RSD＝0.18%）。（2）微柱分離效率。將微柱離心除水，精密量取5 μg·mL－1BSA溶液0.8 mL，加入0.2 mL空白脂質(zhì)體成為混合液。從中精密吸取0.2 mL上柱（n＝4），以下按照“2.4.1”項中“微柱離心分離步驟”項下方法操作，收集離心液；另從混合液中精密吸取0.2 mL，加水0.3 mL，混合后作為混懸液，分別在濾液和混懸液中加10%乳化劑辛基酚聚氧乙烯醚（OP）0.5 mL振搖，按照“2.3.3”項下方法操作，計算A595/A450，代入回歸方程計算離心液及混懸液中BSA的濃度c離心液、c混懸液，根據(jù)柱分離效率（%）＝[1－（c離心液/c混懸液）]×100%計算，得其值大于90%，說明柱分離效率較好。

2.4.3 BSA脂質(zhì)體包封率測定。（1）脂質(zhì)體混懸液中的BSA的含量測定。精密加入0.2 mL BSA脂質(zhì)體混懸液于5 mL容量瓶中，依次加入0.3 mL水、10%乳化劑OP 0.5 mL振搖，按照“2.3.3”項下方法操作，計算A595/A450，代入回歸方程計算混懸液中BSA的含量為c總。（2）脂質(zhì)體中包載的BSA量測定。收集“2.4.1”項中“微柱離心分離步驟”項下獲得離心液，加入乳化劑OP 0.5 mL，按照“2.3.3”項下方法操作，計算A595/A450，代入回歸方程計算脂質(zhì)體中包載BSA的含量c包封。參照文獻[3～6]中公式計算BSA脂質(zhì)體包封率分別為（31.32±0.67）%、（34.68±0.62）%、（32.75±0.83）%，平均值為32.91%（n＝3）。

3 討論

在酸性條件下，考馬斯亮藍染料呈紅色，當其與蛋白質(zhì)結(jié)合時變成藍色，因此考馬斯亮藍染料和考馬斯亮藍-蛋白質(zhì)結(jié)合物有不同的吸光系數(shù)。傳統(tǒng)考馬斯亮藍法利用考馬斯亮藍-蛋白結(jié)合物最大吸收波長595 nm時的吸光度值來反映蛋白質(zhì)的濃度，而忽略了游離考馬斯亮藍染料在此波長下也有一定的吸光度。因此，本試驗利用雙波長法來消除雜質(zhì)吸收的影響從而提高分析的準確度[7，8]。

酶標儀可一次檢測大量標本，所需樣品量少，并能減少系統(tǒng)誤差，因此本試驗是在原有實驗[7]的基礎(chǔ)上運用酶標儀代替紫外-可見分光光度計進行的，以進一步提高檢測靈敏度、降低實驗誤差。

本文中采用層析法將BSA脂質(zhì)體與未包封的游離藥物分離開，經(jīng)過前期的試驗研究[7]，發(fā)現(xiàn)采用交聯(lián)度較高的DEAE-Sephadex A50凝膠可以更加有效地將脂質(zhì)體與BSA分離。試驗中將自制的BSA脂質(zhì)體裝入自制凝膠微柱中，可以實現(xiàn)游離蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體快速、有效的分離，方法簡單易行，相對于普通凝膠層析柱分離法對樣品的稀釋倍率大大降低，適用于測定痕量大分子蛋白質(zhì)脂質(zhì)體的包封率，且還可以用于其他痕量蛋白質(zhì)的測定。

在此次BSA脂質(zhì)體包封率測定試驗中，0.2 mL樣品在經(jīng)過了微柱的分離稀釋、添加破乳劑及酶標儀測定時添加染料等諸多稀釋步驟后，其中蛋白質(zhì)的濃度降至0.3 μg·mL－1左右，接近此方法的檢測濃度下限0.25 μg·mL－1，此乃本方法不足之處，今后試驗還需探索靈敏度更高的檢測方法和手段。

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