超臨界反溶劑法制備葉酸介導(dǎo)吡柔比星葡聚糖納米粒的工藝研究Δ

姜 茹，祖元剛，趙修華，王 丹，祖柏實，孫志強（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱市 150040）

超臨界反溶劑法制備葉酸介導(dǎo)吡柔比星葡聚糖納米粒的工藝研究Δ

姜 茹＊，祖元剛#，趙修華，王 丹，祖柏實，孫志強（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱市 150040）

目的：優(yōu)化可主動靶向癌細(xì)胞的葉酸（FA）介導(dǎo)吡柔比星（PRB）葡聚糖（DEX）納米粒（FA-PRB-DEX-NPs）的制備工藝。方法：采用超臨界反溶劑法制備FA-PRB-DEX-NPs，采用二水平設(shè)計法，以PRB與DEX質(zhì)量比（X1）、DEX濃度（X2）、混合液流速（X 3）、萃取釜溫度（X4）、萃取釜壓力（X5）為因素，以粒徑、載藥量、包封率等為指標(biāo)篩選出最佳工藝條件，計算葉酸偶聯(lián)度，通過掃描電鏡、紅外光譜、X射線衍射分析和差示掃描量熱分析法表征納米粒性質(zhì)。結(jié)果：最佳工藝條件為X1＝0.5、X2＝9.98mg·m L－1、X3＝3.3m L·m in－1、X4＝50 ℃、X5＝15 MPa。以此所制納米粒的平均粒徑、載藥量和包封率分別為（178±15.8）nm、7.73%、33.2%，F(xiàn)A偶聯(lián)度為2.97%。各表征方法結(jié)果顯示納米粒與原藥比較粒徑更小，呈無定形非晶態(tài)。結(jié)論：篩選的制備工藝成功地制備出了可主動靶向癌細(xì)胞表面的FA-PRB-DEX-NPs，且所采用的超臨界反溶劑法方法簡單，更適合工藝化生產(chǎn)。

吡柔比星；葡聚糖；葉酸；超臨界反溶劑法；納米粒；二水平設(shè)計法；制備工藝

吡柔比星（PRB）是一種蒽環(huán)類廣譜腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，但其可致心臟毒性、骨髓抑制、脫發(fā)、黏膜炎及惡心、嘔吐等嚴(yán)重毒副反應(yīng)，因此長久以來一直限制著PRB的臨床應(yīng)用，也一直是化學(xué)結(jié)構(gòu)改造和新劑型研發(fā)工作的焦點[1，2]。所以，制備一種靶向性好、低毒副作用的新型藥物就成為了關(guān)鍵的問題。由于葉酸（FA）受體在正常組織中的表達高度保守，而在大部分惡性腫瘤組織中高度表達，因此，利用FA作為載體進行腫瘤靶向治療受到人們的關(guān)注[3，4]。在本文中，筆者旨在選擇一種合適的表面偶聯(lián)FA的PRB葡聚糖（DEX）納米粒（FA-PRB-DEX-NPs）制備工藝，以實現(xiàn)PRB對腫瘤細(xì)胞的靶向性、克服其毒副作用以及提高其生物利用度。

1 儀器與試藥

紅外光譜儀（日本島津公司）；激光粒度儀（美國布魯克海文儀器公司）；FEIQuanta 200掃描電鏡（荷蘭FEI公司）；磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司）。

PRB對照品（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：071101-3，純度：98.5%）；DEX（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分子量：4萬）；FA（惠世生化試劑有限公司，批號：071008，純度：＞99.0%）；FA-PRB-DEX-NPs（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室研制，載藥量：7.73%）；冰乙酸、高碘酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純。

2 方法

2.1 二水平試驗設(shè)計

本試驗?zāi)康氖菍⒖鼓[瘤藥物PRB制備成FA介導(dǎo)、DEX包被的靶向納米粒，以克服PRB毒副反應(yīng)大且對腫瘤細(xì)胞無定向攻擊能力的缺點。

設(shè)計思路：首先以未偶聯(lián)FA的DEX與PRB為前體通過超臨界反溶劑的方法制備DEX包載PRB納米粒，對試驗數(shù)據(jù)分析篩選出最佳條件，然后在最佳條件的基礎(chǔ)上以FA偶聯(lián)DEX（FA-DEX）取代上述未偶聯(lián)FA的DEX，再經(jīng)超臨界反溶劑方法制備出具有FA靶向性的DEX包載PRB納米粒。

最佳條件下FA-DEX包載PRB靶向納米粒的制備過程如下：首先，將DEX的羥基氧化成醛基后與FA反應(yīng)生成FA-DEX，目的是使制備出的藥物表面帶有FA，能夠主動識別腫瘤細(xì)胞表面的FA受體，起到藥物靶向定位的作用；然后，將FA-DEX和PRB同時溶解在DMSO中，經(jīng)超臨界反溶劑方法制備出FA-DEX包被的PRB靶向納米粒，即FA-PRB-DEXNPs。超臨界反溶劑方法過程如下：FA-DEX和PRB的DMSO混合溶液通過一定孔徑的噴嘴噴入充滿流動的、超臨界態(tài)的CO2萃取釜中，因DEX和PRB不溶于CO2，而DMSO可快速與CO2相溶，致使FA-DEX包被PRB的粒子從DMSO溶液中析出，而被CO2帶走的DMSO在非超臨界態(tài)的分離釜中析出，CO2則可以繼續(xù)循環(huán)利用。此過程制備的納米粒粒徑大小、載藥量和包封率主要由PRB與DEX質(zhì)量比（X1）、DEX濃度（X2）、混合液流速（X3）、萃取釜溫度（X4）和萃取釜壓力（X5）這5種因素決定。所以通過預(yù)試驗首先確定這5種因素的范圍（固定其他4種因素，改變1個因素大小，以能生成粒子為標(biāo)準(zhǔn)），然后利用二水平試驗設(shè)計分析方法以粒徑、載藥量、包封率為判斷指標(biāo)選出最佳工藝處方。各因素水平見表1。

表1 二水平設(shè)計中各因素水平Tab 1 Factorsand levelsof two-level factorialdesign

2.2 納米靶向DEX制備

2.2.1 氧化DEX的制備。取2 g DEX溶解在60m L水中，1.6 g高碘酸鈉溶解在10m L水中，將兩相混合后，室溫避光攪拌24 h（DEX中的羥基氧化率為5%），得無色澄清溶液，將其冷凍干燥，即得白色粉末狀氧化DEX。

2.2.2 FA-DEX的制備。將氧化DEX10mg溶于5m L水中，向其加入3.4mg FA后，室溫避光攪拌24 h。加入與此溶液等體積的冰乙酸，F(xiàn)A-DEX析出，離心（8 000 r·m in－1），棄上清。冰乙酸洗滌沉淀至無DMSO后用無水乙醇清洗至無乙酸殘留，最后將沉淀放入烘箱，60℃烘干，備用。

2.2.3 FA-DEX包載PRB的超臨界反溶劑制備工藝。將FA-DEX與PRB按比例置于40m LDMSO中溶解，經(jīng)超臨界反溶劑方法制備FA-PRB-DEX-NPs粉體。步驟如下：啟動CO2高壓泵，將液化后的CO2以5～20 L·h－1的流速注入結(jié)晶釜，使其壓力動態(tài)平衡在15～30MPa，溫度40～55℃，穩(wěn)定在超臨界狀態(tài)。用高壓柱塞泵將FA-DEX與PRB的DMSO溶液以3.3～13.3m L·min－1的速度通過口徑為150μm噴嘴注入到結(jié)晶釜內(nèi)，溶劑瞬間溶解在CO2中，析出DEX包被的PRB粉體，CO2在結(jié)晶釜內(nèi)繼續(xù)運行1 h左右以干燥生成的納米粉體，

DMSO與CO2在壓力4～6MPa、溫度25～45℃的分離釜中分離，DMSO回收后再利用，CO2氣體直接循環(huán)使用[5～7]。

2.3 理化性質(zhì)

2.3.1 FA偶聯(lián)度測定。首先由FA濃度與其特定波長下的吸光度值制備FA標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將FA-DEX在DMSO中溶解，由于DEX在279 nm波長處無吸收峰，所以此時測定的吸光度值即為FA-DEX上FA的吸光度值，通過FA標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出FA的濃度，然后通過公式計算出FA的偶聯(lián)度：

FA偶聯(lián)度＝（FA濃度×體積）/FA-DEX質(zhì)量×100%。

精密稱取FA約5mg，置于100m L容量瓶中，加入適量DMSO，超聲10min溶解，定容，使成濃度為50 μg·m L－1的FA貯備液，分別精密吸取貯備液0.2、1、2、4、6、16m L，置于各容量瓶中，以DMSO定容至刻度。紫外分光光度計測得溶液在279 nm波長處的紫外吸光度（y），并自動與濃度（x）進行直線回歸分析。

精密稱取適量的FA-DEX溶解于DMSO中，測定其吸光度，然后通過FA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算FA的偶聯(lián)度。

2.3.2 粒徑測定。將少量FA-PRB-DEX-NPs樣品放入10m L試管中，加入適量無水乙醇超聲分散3m in后，用激光粒度儀測定粒徑的大小及粒徑分布情況，每個樣品重復(fù)測3次。由于DEX在無水乙醇中的溶解速率比較慢，所以短時間內(nèi)不會因為樣品的溶解、釋放等原因影響到粒徑的大小。

2.3.3 載藥量測定。精密稱取PRB對照品約15mg，置于10 m L的容量瓶中，加入適量DMSO，超聲10m in溶解，定容，使之成濃度為1.5mg·m L－1的PRB貯備液。依次稀釋2倍共稀釋10次得PRB對照液，分別檢測254 nm波長處的峰面積，然后以峰面積與濃度回歸作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。PRB高效液相效色譜（HPLC）法檢測條件如下：色譜柱為Sigma C18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為4%乙酸銨-乙腈（65∶35），冰乙酸調(diào)pH值至4；檢測波長為254 nm；進樣量為25μL；流速為1m L·m in－1。根據(jù)測得峰面積（y）與濃度（x）之間關(guān)系制備PRB標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝57 158 376.933 9x－357 660.155 5（r2＝0.999 8），即可計算出PRB的濃度，從而計算出其載藥量。

精密稱取FA-PRB-DEX-NPs樣品 10 mg，置于0.5 m L DMSO中超聲溶解，加入2.5m L流動相，震蕩搖勻后，10 000 r·m in－1離心10min。分別吸取對照品和樣品溶液25 μL，注入色譜儀，記錄峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品溶液中的PRB濃度：

載藥量＝被包裹藥物質(zhì)量/（載體質(zhì)量+藥物質(zhì)量）×100%。

2.3.4 包封率測定。將樣品載藥量乘以所得樣品的質(zhì)量，即為被包載的PRB總質(zhì)量，按以下公式計算包封率：

包封率＝被包裹藥物質(zhì)量/投藥量×100%

2.4 納米粒表征

采用紅外光譜、X射線衍射法（XRD）和差示掃描量熱法（DSC）對PRB對照品、DEX和納米粒進行表征。

3 結(jié)果與分析

3.1 二水平試驗

應(yīng)用二水平試驗設(shè)計方法得回歸模型如表2。

上述各水平下FA-PRB-DEX-NPs的粒徑范圍為121.16～487.27 nm，載藥量和包封率分別為0.29%～8.00%、9.74%～38.41%。

表2 二水平設(shè)計模型Tab 2 Experim entaldesign of two-level factorialdesign

3.2 FA偶聯(lián)度與最優(yōu)條件

通過FA標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.068 7x+0.013 6（r2＝0.998 6），計算出FA偶聯(lián)度為2.97%，此時FA的量足夠?qū)A-PRB-DEX-NPs介導(dǎo)到癌細(xì)胞表面，使癌細(xì)胞表面聚集大量藥物從而起到抗癌的作用[5，8]。

將表2的結(jié)果經(jīng)Design-Exper 7.0軟件分析，得出最佳工藝條件如下：X1即PRB與DEX質(zhì)量比為0.5；X2即DEX濃度為9.98mg·m L－1；X3即混合液流速為3.3m L·m in－1；X4即萃取釜溫度為50℃；X5即萃取釜壓力為15MPa。此條件下FA-PRB-DEX-NPs載藥量為0.7%，包封率為5.4%，平均粒徑為（172.3±21.1）nm，粒徑分布均勻，見圖1。

圖1 粒徑分布Fig 1 Distribution of particle size

盡管選擇出的是各方面都比較優(yōu)越的最佳條件，但載藥量依然很低，因此筆者想通過改進制備方法以得到載藥量、包封率更好的納米粒。

保持處方不變，但在經(jīng)超臨界反溶劑制備之前，將FA-DEX與PRB按試驗設(shè)計比例溶于含2%乙酸的水中，避光攪拌12 h后，冷凍干燥，此時的PRB大部分吸附在DEX上，將此凍干樣品通過同樣的超臨界反溶劑方法在篩選出的最優(yōu)條件下制備FA-PRB-DEX-NPs。而這種經(jīng)過吸附的FA-DEXPRB制備出的納米粒載藥量和包封率都明顯高于未經(jīng)攪拌吸附的PRB，包封率達33.2%，載藥量達7.73%，平均粒徑為（178±15.8）nm。這樣，經(jīng)過攪拌吸附制得的FA-PRB-DEXNPs不僅粒徑?jīng)]有太大變化，同時極大地提高了DEX的載藥量和包封率，使DEX包載PRB作為一種新藥應(yīng)用到臨床成為可能。

3.3 粒徑與形貌分析

藥物溶解性是影響藥物生物利用度的重要因素之一，難溶性藥物因在水中的溶解度小，難以被機體吸收，導(dǎo)致生物利用度較差，因此，粒徑的大小是影響藥物分散、吸收利用的關(guān)鍵因素，所以本試驗將粒徑作為一項重要的評價指標(biāo)。PRB對照品、DEX、FA-PRB-DEX-NPs粒徑掃描電鏡見圖2。

圖2 掃描電鏡照片a.PRB對照品；b.DEX；c.FA-PRB-DEX-NPsFig 2 SEM photographsa.PRB control；b.DEX；c.FA-PRB-DEX-NPs

如圖2所示，PRB對照品粒徑大約50μm左右，DEX長徑為大于20μm的長條形結(jié)晶，F(xiàn)A-PRB-DEX-NPs平均粒徑為（178±15.8）nm，為分布均勻的球體。通過圖2可以明顯看出，經(jīng)超臨界反溶劑方法制備的樣品粒徑遠遠小于未經(jīng)過處理的DEX與PRB對照品粒徑。表明超臨界方法的應(yīng)用不僅可改善藥物水溶性、載藥量的問題，同時此方法制備出的納米粉體無溶劑殘留，在提高生物利用度的同時，也降低了對細(xì)胞的毒副作用。

3.4 紅外光譜分析

先將PRB對照品、DEX和FA-PRB-DEX-NPs進行干燥后，以溴化鉀壓片法獲得室溫下的紅外光譜圖，見圖3。

圖3 紅外光譜圖Fig 3 FTIR spectra

通過圖3可以明顯看出，PRB經(jīng)FA-DEX包裹后已經(jīng)不再顯示其原本的結(jié)構(gòu)特征，而是顯示DEX的結(jié)構(gòu)特征，這說明用此方法獲得的PRB已經(jīng)完全被載體DEX所包裹。因此，在PRB進入生物體殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中，F(xiàn)A能夠真正地起到靶向誘導(dǎo)的作用，將藥物帶到特定部位。

3.5 XRD分析

采用測定納米粒X射線的衍射強度來進一步確定納米粒的晶體結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖4 XRD分析圖Fig 4 XRD spectra

由圖4 PRB在納米化前、后XRD譜圖的對比可以明顯地看出，PRB對照品在2θ＝10.32°、18.66°、21.26°、32.2°有明顯峰值，證明未經(jīng)處理的PRB有很強的X衍射強度，為晶體結(jié)構(gòu)；而經(jīng)過納米化之后的粒子沒有明顯的X衍射峰，這就證明經(jīng)過超臨界反溶劑方法處理后的FA-PRB-DEX-NPs已經(jīng)明顯顯示出了非晶體狀態(tài)，極大地增大了藥物的溶解度。

3.6 DSC分析

PRB對照品、DEX、FA-PRB-DEX-NPs的DSC分析見圖5。

圖5 DSC分析圖Fig5 DSCspectra

由圖5可以明顯看出，PRB對照品在202.30℃處有1個吸熱峰，DEX在172.84℃和263.80℃均有吸熱峰，而經(jīng)超臨界納米化處理之后的FA-PRB-DEX-NPs無任何吸收峰存在，說明經(jīng)此納米化后的粒子呈現(xiàn)無定形非晶態(tài)特征。

4 討論

本試驗采用二水平析因分析方法，以PRB為包被核心，選用DEX為包被載體（DEX與FA偶聯(lián)），經(jīng)超臨界反溶劑法制備出表面有FA偶聯(lián)的DEX包載PRB納米粒。超臨界反溶劑法制備納米粒的優(yōu)點在于，納米粒分布均勻、無溶劑殘留，制備方法簡單且周期短，是一種良好的納米化制備方法，應(yīng)用也比較廣泛。

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，納米粒的載藥量不高，但在相同處方中如果將FA-DEX與PRB通過攪拌凍干之后再經(jīng)超臨界反溶劑方法制備FA-PRB-DEX-NPs，載藥量和包封率都明顯高于未經(jīng)攪拌凍干的FA-DEX-PRB。這說明在攪拌凍干的過程中PRB大部分吸附在DEX的表面；而將FA-DEX-PRB的DMSO混合液噴入萃取釜之前，由于時間短暫，PRB未脫離FA-DEX的表面即被強制包裹在DEX的納米粒之中，形成比未經(jīng)過吸附的FADEX載藥量高近10倍的FA-PRB-DEX-NPs。

FA-PRB-DEX-NPs成功制備為今后PRB的活性研究提供了可靠的實驗基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。通過本試驗改進方法之后的工藝條件更適合實際生產(chǎn)和應(yīng)用。

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Preparation of Folic Acid-conjugated Pirarubicin-loaded Dextran Nanoparticles by Supercritical Antisolvent M ethod

JIANG Ru，ZU Yuan-gang，ZHAO Xiu-hua，WANG Dan，ZU Bai-shi，SUN Zhi-qiang（Key Laboratory of Forest Plant Ecology，M inistry of Education，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

OBJECTIVE：To optim ize the preparation technology of folic acid（FA）-conjugated pirarubicin（PRB）-loaded dextran（DEX）nanoparticles（FA-PRB-DEX-NPs）for tumor-targeted drug delivery.METHODS：Supercritical anti-solventmethod was adopted to prepare FA-PRB-DEX-NPs.The ratio of PRB to DEX（X1），DEX concentration（X2），flow rate ofm ixture（X3），extraction temperature（X 4），and extraction pressure（X5）as factors and w ith particle size，drug-loading rate，entrapment efficiency as index were adopted to optimize the preparation technology of FA-PRB-DEX-NPs using two-level factorial design.The coupled conjugate rate of folic acid was calculated and the particles were detected by FTIR，XRD，DSC，SEM.RESULTS：Optimal condition was as follows：X1＝0.5，X2＝9.98mg·m L－1，X3＝3.3 m L·m in－1，X4＝50 ℃，X5＝15 MPa.Mean particle size，drug-loading rate and entrapment efficiency of nanoparticleswere（178±15.8）nm，7.73%，33.2%.The coupled conjugate rate of folic acid was 2.97%.The particle size of nanoparticles was smaller than that of original ones，assumed as amorphous state.CONCLUSION：FA-PRB-DEX-NPs for tumor-targeted drug delivery have been prepared through the supercritical antisolventmethod，which is simple and suitable for industrialization.

Pirarubicin；Dextran；Folic acid；Supercritical antisolvent method；Nanoparticles；Two-level factorial design；Preparation technology

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）21-1961-04

Δ國家林業(yè)局“948”項目（2010-4-20）；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（2010040072）；東北林業(yè)大學(xué)研究生論文資助項目

＊在讀本科生。研究方向：制劑學(xué)。E-mail：jiangyu224@163.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：植物化學(xué)與植物藥。電話：0451-82191517。E-mail：zygorl@yahoo.com.cn

2010-12-17

2011-02-05）