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    SUD-35/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其小鼠體內(nèi)藥效學(xué)初步研究

    2011-11-17 07:45:24潘振華劉煥龍陳雪彥向柏方瑜張永健
    中國藥房 2011年21期
    關(guān)鍵詞:抑瘤率微絲藥效學(xué)

    潘振華,劉煥龍,陳雪彥,向柏,方瑜,張永健#

    (1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊市050017;2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室,石家莊市 050017;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,石家莊市 050003)

    SUD-35/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其小鼠體內(nèi)藥效學(xué)初步研究

    潘振華1*,劉煥龍2,陳雪彥3,向柏1,方瑜1,張永健3#

    (1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊市050017;2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室,石家莊市 050017;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,石家莊市 050003)

    目的:制備苯甲酰脲類微管微絲抑制劑SUD-35/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(SUD-35/HP-β-CD),以提高SUD-35的水溶性和穩(wěn)定性,并對其小鼠體內(nèi)藥效學(xué)進(jìn)行初步考察。方法:采用飽和水溶液法,以SUD-35/HP-β-CD投藥比(A)、包合溫度(B)、包合時間(C)、攪拌速度(D)為考察因素,以包合率為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)篩選最佳制備工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和溶解度測定;以差示掃描量熱(DSC)法及X射線衍射(XRD)法驗(yàn)證包合物;對肝癌H22細(xì)胞實(shí)體瘤模型小鼠腹腔注射包合物低、中、高劑量(以SUD-35計(jì))每日1次,共7 d,計(jì)算末次給藥后24 h的抑瘤率,并與環(huán)磷酰胺比較。結(jié)果:最佳制備工藝為A:1∶5,B:50℃,C:60 min,D:100 r·min-1;以此工藝所制3批包合物的平均包合率約為75.8%;SUD-35原料及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L-1;DSC和XRD法證實(shí)包合物形成;低、中、高劑量抑瘤率分別為(38.25±0.57)%、(63.45±1.20)%、(69.26±1.15)%,環(huán)磷酰胺組為(71.52±1.16)%。結(jié)論:SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡便、易行,可極大地提高SUD-35的水溶性,其高劑量對肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長具有與環(huán)磷酰胺相似的抑制作用。

    微管微絲抑制劑;SUD-35;羥丙基-β-環(huán)糊精;包合物;正交試驗(yàn);小鼠;肝癌H22細(xì)胞;抑瘤率

    微管和微管蛋白是靶向篩選抗腫瘤藥物的篩選模型之一。微管微絲抑制劑通過干擾細(xì)胞分裂中紡錘體的形成使細(xì)胞停滯在有絲分裂中期,阻斷細(xì)胞分裂增殖,同時由于微管微絲是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?,干擾微管微絲的形成可影響與凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞凋亡,該類藥物稱為微管微絲抑制劑。隨著紫杉醇的出現(xiàn)和人們對于微管微絲生物學(xué)特性的認(rèn)識[1],微管微絲類抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)日益引起人們的關(guān)注與興趣。SUD-35(其分子量為419,屬苯甲酰脲類,化名名稱為N-[4-(4,6-二甲氧基-2-嘧啶氧基)-3-甲基苯基]-N′-[2-(二甲氨基)]苯甲酰脲)是我院藥物化學(xué)教研室全合成的新型小分子微管微絲抑制劑。由于其幾乎不溶于水,因此將其制成制劑必須首先解決其溶解性的問題,而對藥物進(jìn)行包合則是一種解決之法。羥丙基-β-環(huán)糊精(Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)是一種低毒、安全、有效的水溶性包合材料[2]。本試驗(yàn)采用飽和水溶液法,通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)選出最佳包合工藝,制備了SUD-35/HP-β-CD包合物,并對其進(jìn)行了初步的小鼠體內(nèi)藥效學(xué)考察,為其制劑的制備和臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    差示分析儀(美國PerkinElmer公司);D/max2400轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(日本理學(xué)株式會社);TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器廠);HR型分析天平(日本AND公司);精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

    1.2 試藥

    SUD-35對照品(批號:090615,含量:99.1%)、SUD-35原料藥(批號:090618,含量:99.0%)、SUD-35/HP-β-CD包合物(批號:091216,含藥量:10.8%)均為河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室自制;HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司,取代度:5.2);注射用環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司,批號:091001,規(guī)格:每支0.2 g);其他試劑均為分析純。

    1.3 動物

    6~8周齡清潔級昆明種小鼠,體重18~22 g,♀♂各半,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:醫(yī)動字第602086號。

    1.4 細(xì)胞株

    小鼠肝癌H22瘤株,由河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 包合物含量測定方法

    2.1.1 測定波長的選擇。精密稱取SUD-35對照品及HP-β-CD適量,分別制備成一定濃度的80%甲醇溶液,在200~400 nm波長范圍內(nèi)掃描,結(jié)果表明,SUD-35在232 nm波長處有最大吸收,而HP-β-CD在此處無干擾,故選232 nm波長為測定波長。光譜見圖1。

    圖1 紫外掃描光譜圖Fig 1 UV scanning spectrum

    2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取SUD-35對照品20 mg,置于100 mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,作為貯備液。精密量取貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL,置于100 mL容量瓶中,加80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,在232 nm波長處測定吸光度(A),以吸光度對濃度(c)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A=0.080 2c+0.000 3(r2=0.999 6)。結(jié)果,SUD-35檢測濃度線性范圍為1.0~12.0 μg·mL-1。

    2.1.3 回收率試驗(yàn)。分別精密吸取對照品貯備液制備低、中、高(1.0、6.0、12.0 μg·mL-1)3種濃度的樣品,加入相應(yīng)量的HP-β-CD(摩爾比為1∶1),測定吸光度,計(jì)算平均回收率為98.82%,RSD=0.57%(n=6)。

    2.1.4 精密度試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下制備的低、中、高3種濃度溶液,按相關(guān)方法分別測定日內(nèi)及日間精密度,測得日內(nèi)RSD分別為0.71%、0.39%、0.47%(n=6);日間RSD分別為0.46%、0.64%、0.53%(n=6)。

    2.1.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。用80%甲醇制備濃度為6 μg·mL-1的對照品溶液,在室溫下放置1、2、4、8、12、24 h,在232 nm波長處測定其吸光度,結(jié)果RSD=0.51%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.2 包合物的制備[3,4]

    2.2.1 包合物的制備。采用飽和水溶液法,制備SUD-35/HP-β-CD包合物:精密稱取HP-β-CD,加蒸餾水適量,攪拌制成一定溫度下的飽和溶液。另精密稱取一定量的SUD-35,用適量甲醇溶解后,不斷攪拌下緩緩滴入HP-β-CD飽和溶液中,恒溫?cái)嚢柚烈?guī)定時間,放冷至室溫,置于冰箱中冷藏24 h后取出,抽濾,沉淀用適量甲醇洗滌,收集沉淀物,低溫真空干燥,得白色粉末狀包合物。

    2.2.2 SUD-35/HP-β-CD包合物最佳制備工藝的選擇。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇SUD-35/HP-β-CD投藥比(A)、包合溫度(B)、包合時間(C)、攪拌速度(D)為考察因素,各取3個水平,用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。以SUD-35包合率(包合物中SUD-35含量/投料量值)作為評價指標(biāo)篩選最佳工藝條件。其因素水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2、表3。

    表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

    表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

    由表2可知,4因素對評價指標(biāo)影響程度由大到小排列順序?yàn)锳>B>C>D,即投藥比影響最大,攪拌速度影響最小。由表3可知,因素A對SUD-35的包合有顯著性影響,因此結(jié)合實(shí)際情況選定最佳包合工藝條件為A1B2C3D1,即SUD-35與HP-β-CD投藥比為1∶5,包合溫度為50℃,包合時間為90 min,攪拌速度100 r·min-1。

    按上述優(yōu)選確定的方法制備包合物樣品,共3批,結(jié)果其包合率分別為74.9%、78.5%、74.0%。表明用最佳處方及工藝制備的包合物包合率較高,平均包合率為75.8%(n=3),且結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

    2.2.3 溶解度試驗(yàn)[5]。取SUD-35及其包合物適量,分別加新沸放冷的水制備成飽和溶液,渦旋30 min,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。取續(xù)濾液用純化水稀釋進(jìn)行測定、計(jì)算。結(jié)果,SUD-35及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L-1,可見形成包合物后,SUD-35在水中的溶解度增大了2 000倍左右,這也從另一個側(cè)面說明了包合物的形成。

    2.3 包合物的鑒定

    2.3.1 差示掃描量熱(DSC)法鑒定包合物。分別將SUD-35原料、HP-β-CD、HP-β-CD與SUD-35的物理混合物及SUD-35/HP-β-CD包合物進(jìn)行DSC分析。以空鋁皿為參比,另一鋁皿中放入樣品,升溫速度為10 ℃·min-1,N2流速為20 mL·min-1,升溫范圍是30~150℃。結(jié)果顯示,各不相同的波峰和吸收峰的溫度值,SUD-35為118.0℃,HP-β-CD為69 ℃,HP-β-CD與SUD-35的物理混合物分別為70℃和119℃,說明二者的混合是物理混合。包合物完全形成新的熱分析圖,在105℃有吸收峰,證明包合物已經(jīng)形成,結(jié)果見圖2。

    圖2DSC圖Fig 2 DSC patterns

    2.3.2 X射線衍射(XRD)試驗(yàn)。分別將SUD-35、HP-β-CD、SUD-35與HP-β-CD物理混合物、包合物約0.05 g進(jìn)行測定。測定條件:Cu靶,Ni濾波器,電壓:20 kV,電流:20 mA,接受裂縫寬度:0.3 mm,掃描范圍:5~40°(2θ),步長:0.05°·s-1。XRD試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

    圖3XRD圖Fig 3 X-ray diffraction patterns

    圖3結(jié)果表明,SUD-35和HP-β-CD具有明顯不同的衍射峰,物理混合物中既有HP-β-CD的衍射峰,又有SUD-35的衍射峰,是SUD-35和HP-β-CD的衍射峰疊加。包合物不同于物理混合物,SUD-35的部分特征衍射峰消失或位移,表明確實(shí)形成了包合物。

    2.4 SUD-35/HP-β-CD包合物體內(nèi)藥效學(xué)考察

    2.4.1 動物模型的建立[6]。取腹腔內(nèi)傳代7 d的肝癌H22小鼠,脫頸椎處死,用滅菌空針穿過腹肌,抽吸腹水,放入滅菌容器內(nèi),置于冰塊上保存。腹水用滅菌生理鹽水按1∶3稀釋,制得H22腫瘤細(xì)胞懸液。無菌條件下每只小鼠右腋窩皮下注射H22腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL,制備H22實(shí)體瘤模型。

    2.4.2 SUD-35/HP-β-CD包合物體內(nèi)抗腫瘤作用的評價。制備H22實(shí)體瘤模型后,于接種次日,50只小鼠按體重隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為陰性對照組(腹腔注射生理鹽水)、陽性對照組(腹腔注射環(huán)磷酰胺(CPP)5 mg·kg-1)和包合物低、中、高劑量組(分別腹腔注射相當(dāng)于含SUD-35 5、10、15 mg·kg-1的SUD-35/HP-β-CD包合物),每日1次,共7 d(各給藥劑量根據(jù)常見抗腫瘤藥物紫杉醇的人用臨床劑量換算而得)。于末次給藥后24 h頸椎脫臼處死小鼠,完整剝?nèi)×鼋M織,稱瘤重,計(jì)算每組瘤重平均值與標(biāo)準(zhǔn)差,按下式計(jì)算各給藥組抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%。式中,T為實(shí)驗(yàn)組即包合物組和陽性對照組平均瘤重,C為陰性對照組平均瘤重。各組抑瘤率結(jié)果見表4。

    表4 各組抑瘤率結(jié)果(x ±s,n=10)Tab 4Tumor inhibition rate of each grou(px ±s,n=10)

    表4結(jié)果表明,SUD-35/HP-β-CD包合物對肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長有顯著的抑制作用,并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

    3 討論

    由于CD具有獨(dú)特的內(nèi)疏水、外親水的結(jié)構(gòu)而可與許多尺寸適宜的客體分子形成包合物,因此其常用來增加藥物的水溶性、增強(qiáng)穩(wěn)定性、降低毒副作用、控制藥物釋放、提高生物利用率。

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,SUD-35與HP-β-CD簡單的物理混合不能制備得到包合物。而采用飽和水溶液法,成功制得了SUD-35/HP-β-CD包合物。

    利用HP-β-CD的包合,SUD-35溶解度提高了2 000倍左右,從而有可能提高SUD-35的口服生物利用度。同時,其水溶性的提高為今后開發(fā)成多種劑型提供了研究基礎(chǔ)。

    SUD-35制備成包合物后,通過其對小鼠體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SUD-35/HP-β-CD包合物對荷H22實(shí)體瘤小鼠有顯著的抑瘤作用,為其進(jìn)一步抗腫瘤研究提供了參考,因此,本實(shí)驗(yàn)具有一定的實(shí)用價值。

    綜上所述,SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡便、易行,可極大地提高SUD-35的水溶性,并對肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長有顯著的抑制作用。

    [1] 李建農(nóng),蔣建東.微管的生物學(xué)特性與藥物研究[J].藥學(xué)學(xué)報,2003,38(4):311.

    [2] 冉懋雄,周厚瓊.藥劑輔料與新藥開發(fā)[J].中國藥房,1996,7(2):53.

    [3] 何仲貴.環(huán)糊精包合物技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:80-114.

    [4] 陸 斌.藥物新技術(shù)與新劑型[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:40.

    [5] 王 浩,顧吉晉,鄧英杰.氫氯噻嗪-β-環(huán)糊精包合物的制備[J].中國藥房,2008,19(25):1 963.

    [6] 徐叔云,卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:1 647.

    Preparation of Inclusion Compound of SUD-35/HP-β-cyclodextrin and Its Pharmacodynamics Study on Mice in Vivo

    PAN Zhen-hua,XIANG Bai,F(xiàn)ANG Yu(College of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)
    LIU Huan-long(Dept.of Pharmacology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)
    CHEN Xue-yan,ZHANG Yong-jian(Dept.of Pharmacy,The Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050003,China)

    OBJECTIVE:To prepare the inclusion compound of benzoylurea antitubulin SUD-35/HP-β-CD in order to increase the solubility and stability of SUD-35,and to investigate its pharmacodynamics in vivo.METHODS:The inclusion compound was prepared by saturated solution method.The preparation technology of inclusion compound was optimized by orthogonal experiments using ratio of SUD-35/HP-β-CD(A),inclusion temperature(B),inclusion time(C)and stirring rate(D)as factors and with inclusion rate as index.The validation test and solubility determination were conducted.DSC and X-ray diffraction(XRD)were used to verify the complex.Hepatic cancer H22cell solid tumor model mice were given intraperitoneal injection of inclusion compounds at low-dose,medium-dose and high-dose(SUD-35)once a day for 7 days.The tumor inhibition rate was calculated 24 h after the last administration and compared with cyclophosphamide.RESULTS:The optimal preparation technology was as follows:A :1∶5,B:50 ℃,C:60 min,D:100 r·min-1.The average inclusion rate of 3 batches was 75.8%.The solubilities of SUD-35 raw material and inclusion compound in water were 0.000 32 g·L-1and 0.65 g·L-1.The formation of inclusion compound was verified by DSC and XRD method.The tumor inhibition rates at low-dose,medium-dose and high-dose were(38.25±0.57)%,(63.45±1.20)%,(69.26±1.15)%,the cyclophosphamide group was(71.52±1.16)%.CONCLUSION:The preparation technology of inclusion compound of SUD-35/HP-β-CD is simple and feasible.It strengthens the water-solubility of SUD-35,and the high dose of it has similar inhibition on the growth of hepatic cancer H22cells in mice with cyclophosphamide.

    Antitubuli;SUD-35;HP-β-cyclodextrin;Inclusion compound;Orthogonal experiment;Mice;Hepatic cancer H22cells;Tumor inhibition rate

    R943;R979.1

    A

    1001-0408(2011)21-1982-03

    *講師,博士研究生。研究方向:藥物新劑型及腫瘤藥理學(xué)。電話:0311-86265591。E-mail:aaapzh@sohu.com

    #通訊作者:教授,博士。研究方向:心血管及腫瘤藥理學(xué)。電話:0311-86266821。E-mail:zhangyj@hebmu.edu.cn

    2010-08-17

    2010-09-30)

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