紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細(xì)胞增殖的協(xié)同作用

陳　虹，張閃閃，董錦蕾，鐘　晶，王曉琴，張　波

(石河子大學(xué) 1.藥學(xué)院，2.省部共建新疆特種資源植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子　832002)

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紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細(xì)胞增殖的協(xié)同作用

陳虹1,2，張閃閃1,2，董錦蕾1,2，鐘晶1,2，王曉琴1，張波1,2

(石河子大學(xué) 1.藥學(xué)院，2.省部共建新疆特種資源植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832002)

摘要：目的研究紫檀茋和乙酰紫草素對(duì)B16F10細(xì)胞的增殖抑制的協(xié)同作用與相關(guān)機(jī)制。方法通過(guò)系統(tǒng)藥理學(xué)的方法對(duì)紫檀茋和乙酰紫草素的聯(lián)合作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)可能靶點(diǎn)進(jìn)行篩選及分析。體外采用MTT法測(cè)定紫檀茋、乙酰紫草素及聯(lián)合用藥對(duì)B16F10細(xì)胞的抑制效應(yīng)；形態(tài)學(xué)水平觀察細(xì)胞核的凋亡情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期的變化；RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用C57BL/6小鼠移植瘤方法。結(jié)果紫檀茋有14個(gè)靶點(diǎn)與周期相關(guān)，乙酰紫草素有12個(gè)靶點(diǎn)與凋亡相關(guān)，且均有靶點(diǎn)與p53信號(hào)通路相關(guān)。紫檀茋、乙酰紫草素及聯(lián)合用藥對(duì)B16F10細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈濃度劑量依賴性，并具有顯著協(xié)同效果；聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率最高，且周期阻滯在G1期；單一給藥組的p53、Bax及p21基因的表達(dá)隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而B(niǎo)cl-2、CDK2、Cyclin E基因的表達(dá)隨給藥時(shí)間而減少，聯(lián)合給藥組p53，Bax和Bcl-2的變化差異較單獨(dú)給藥組顯著；體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)給藥組均有不同程度的抑瘤效果，以聯(lián)合給藥組抑瘤率最大。結(jié)論紫檀茋和乙酰紫草素對(duì)B16F10細(xì)胞的增殖有一定協(xié)同抑制作用，認(rèn)為二者協(xié)同激活p53信號(hào)通路，誘導(dǎo)周期阻滯和凋亡而發(fā)揮藥效。

關(guān)鍵詞：黑色素瘤；紫檀茋；乙酰紫草素；聯(lián)合用藥；凋亡；細(xì)胞周期；抑瘤率

馬錢(qián)子蜈蚣膏方劑的主要活性成分紫檀茋和乙酰紫草素[1]，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)腫瘤均具有較好的療效[2-3]。紫檀茋是一種低毒的二苯乙烯結(jié)構(gòu)白藜蘆醇衍生物，其具有良好的抗炎、抗氧化等活性[4]。而乙酰紫草素屬于有毒的萘醌類結(jié)構(gòu)，具有抗菌、助氧化等活性，對(duì)多種癌癥細(xì)胞株的IC50<10 μmol·L-1，并且能引起細(xì)胞凋亡，甚至壞死[5-6]。目前僅有文獻(xiàn)報(bào)道紫草提取物對(duì)B16F10黑色素瘤的抗腫瘤活性[7]。紫檀茋和乙酰紫草素是否存在協(xié)同的抗腫瘤藥效，尚不明確。為了闡述馬錢(qián)子蜈蚣膏方劑中的兩種活性成分的可能藥理作用，本研究以黑色素瘤體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合系統(tǒng)藥理分析其相關(guān)機(jī)制。

Fig 1　Structure of pterostilbene and acetylshikonin

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；C57BL/6小鼠購(gòu)于新疆醫(yī)學(xué)院。

1.2主要藥物及試劑

乙酰紫草素(ACS，純度98%)及紫檀茋(PTER，純度98%)，上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)509D043；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)20150512；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，Gibco公司，批號(hào)1643132；MTT、Hoechst 33258染液為北京索萊寶公司，批號(hào)為303H058、20150814；Annexin V/FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20150922；PI染料，購(gòu)于美國(guó)Becton dickinson公司，批號(hào)2226867；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司，批號(hào)AK5401；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒，為上海生工公司產(chǎn)品，批號(hào)13909KA1108；引物均購(gòu)自上海生工。

1.3主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 3131，Thermo，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(ZHJH 1112B，智誠(chéng)分析儀器，上海)；倒置熒光顯微鏡(MIC00266，Zeiss，德國(guó))；倒置生物顯微鏡(BDS200 PH，奧特光學(xué)儀器，重慶)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo VarioFlash 3001，Thermo，美國(guó))；低溫離心機(jī)(5424，Eppendorf，德國(guó))；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD，美國(guó))。

2方法

2.1活性化合物的篩選

馬錢(qián)子蜈蚣膏方劑由馬錢(qián)子、蜈蚣、紫草和血竭各等分組成，且對(duì)皮膚癌有一定療效。本研究采用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)挖掘獲得4味藥中156個(gè)活性化合物，依據(jù)化合物的脂水分布系數(shù)(alogP)和類藥性(DL)等性質(zhì)，及所含腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)量，與腫瘤疾病的相關(guān)性篩選出化合物乙酰紫草素和紫檀茋，采用這兩種化合物的聯(lián)合用藥驗(yàn)證此處方對(duì)皮膚癌的療效。同時(shí)挖掘出其相關(guān)的靶點(diǎn)群，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證[8]。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好B16F10細(xì)胞，用含10%胎牛血清、青霉素(終濃度100 kU·L-1)及鏈霉素(終濃度100 mg·L-1)的DMEM培養(yǎng)液(pH=7.5)，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.3細(xì)胞抑制率的測(cè)定

96孔培養(yǎng)板上，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液體積為100 μL，24 h后加入不同濃度的乙酰紫草素(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol·L-1)，紫檀茋(0、15、30、45、60、75、90、105 μmol·L-1)，聯(lián)合給藥(乙酰紫草素分別為0、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol·L-1，紫檀茋均為20 μmol·L-1)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37 ℃分別培養(yǎng)24 h，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800×g離心5 min棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度(OD)值，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[9]：

2.4倒置顯微鏡觀察B16F10細(xì)胞的形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16F10細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)上，用吸管吹打細(xì)胞瓶壁，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為1×105個(gè)，并接種在6孔板上，每孔加2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯(lián)合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，藥物作用24 h后，分別在倒置顯微鏡下拍照觀察其形態(tài)的變化[9]。

2.5Hoechst 33258熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，按每孔1×105個(gè)置于預(yù)先置入玻璃蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯(lián)合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，在孵育24 h后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2遍，每孔加入1 mL固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)，固定15 min，去除固定液，用PBS洗2遍，加入10 μg·L-1的Hoechst 33258，染色10 min，用PBS洗2遍，之后將蓋玻片放于載玻片之上，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)凋亡情況[10]。

2.6流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加細(xì)胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯(lián)合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，孵育24 h后收集細(xì)胞，用冷PBS洗1遍后，置0℃水浴中，加500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V和5 μL PI，輕輕混勻細(xì)胞，10 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)[11]。

2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加細(xì)胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯(lián)合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，孵育24 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇固定過(guò)夜。次日離心洗滌后，加入25 mg·L-1的RNase和50 mg·L-1的 PI，避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，用Modfit軟件分析數(shù)據(jù)[10]。

2.8RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子

分別按終濃度為紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯(lián)合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)處理細(xì)胞0、6、12、24 h。使用UNIQ 10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取RNA，并用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增條件為：熱啟動(dòng)，起始溫度94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火溫度根據(jù)引物而設(shè)，30 s；延伸72℃，30 s；重復(fù)延伸72℃，5 min；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)22～28。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(2%)電泳后，使用核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析[9]。引物序列及退火溫度見(jiàn)Tab 1。

2.9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞用胰酶消化后收集，將0.2 mL含有2×106個(gè)細(xì)胞的懸液注射到C57BL/6小鼠右側(cè)腋下區(qū)域。腫瘤接種24 h后，嚴(yán)格按隨機(jī)數(shù)字表示分成6組[模型組、溶劑對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組20 mg·kg-1、紫檀茋組60 mg·kg-1，乙酰紫草素組6 mg·kg-1，聯(lián)合用藥組(紫檀茋60 mg·kg-1和乙酰紫草素6 mg·kg-1)]，紫檀茋和乙酰紫草素用玉米油溶解，每組6只，做黑色素瘤的抑瘤率實(shí)驗(yàn)。環(huán)磷酰胺每日腹腔注射給藥，紫檀茋每日灌胃給藥，乙酰紫草素隔日灌胃，給藥10 d后，頸部脫臼處死小鼠，剝離腋下瘤，并稱重拍照。腫瘤抑瘤率/%=[1-(給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)]×100%[13]。

Tab 1　Primer sequence table[12]

2.10數(shù)據(jù)分析

3結(jié)果

3.1靶點(diǎn)群

紫檀茋的靶點(diǎn)中有14個(gè)是與周期相關(guān)的(淡紫色)，乙酰紫草素靶點(diǎn)中有12個(gè)是與凋亡相關(guān)的(粉色)，且紫檀茋和乙酰紫草素分別有6、9個(gè)靶點(diǎn)與p53信號(hào)通路相關(guān)(淡紫色與粉色交集)(Fig 2)。

Fig 2　The network for pterostilbene and acetylshikonin and their candidate targets

3.2聯(lián)合用藥對(duì)B16F10細(xì)胞有明顯的協(xié)同作用

紫檀茋對(duì)B16F10細(xì)胞的24 h半數(shù)抑制濃度(IC50) 為78 μmol·L-1，乙酰紫草素對(duì)B16F10細(xì)胞的24 h半數(shù)抑制濃度(IC50) 為2.7 μmol·L-1，紫檀茋和乙酰紫草素對(duì)B16F10細(xì)胞的抑制作用均隨作用濃度與時(shí)間增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的時(shí)效與量效關(guān)系(Fig 3)。二者聯(lián)合用藥的(IC50)為紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素1.1 μmol·L-1，從中可以看出聯(lián)合給藥能明顯抑制B16F10細(xì)胞的增長(zhǎng)。當(dāng)紫檀茋濃度為20 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)B16F10細(xì)胞的抑制率為15.1%，乙酰紫草素濃度為0.5 μmol·L-1時(shí)，抑制率為12.3%，當(dāng)以這兩種藥物濃度共同作用于B16F10細(xì)胞時(shí)，抑制率達(dá)到37.7%，明顯高于單一用藥的抑制率。

Fig 3　Changes in melanoma cell viability by afterinvitroacetylshikonin,pterostilbene and combination of both±s,n=3)

Fig 4　Effect of treatment on morphological changes of B16F10 cells

A:Morphological changes of B16F10 treated with pterostilbene, acetylshikonin, and combination of both under microscope (×200);B: Morphological changes of B16F10 treated with pterostilbene, acetylshikonin, and combination of both observed by Hoechst 33258 stain(×400)

3.3聯(lián)合用藥誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

普通光鏡下觀察正常組、紫檀茋組、乙酰紫草素組、聯(lián)合用藥組，可以看到給藥后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，以聯(lián)合給藥組的抑制程度最為明顯。細(xì)胞核DNA經(jīng)Hoechst熒光試劑染色后，聯(lián)合用藥組出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，核固縮、碎裂及凋亡小泡不均一化形態(tài)。紫檀茋組基本上沒(méi)出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，乙酰紫草素有凋亡現(xiàn)象，但較聯(lián)合用藥組凋亡現(xiàn)象少。見(jiàn)Fig 4。

3.4聯(lián)合用藥誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡率明顯升高

由Fig 5可知，20 μmol·L-1的紫檀茋處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率為3.4%，與對(duì)照組的3.0%相差不大。在相同條件下，0.5 μmol·L-1的乙酰紫草素的凋亡率為6.7%。二者聯(lián)合用藥后凋亡率明顯升高，為11.5%(P<0.05)且有部分晚期凋亡的細(xì)胞。

3.5聯(lián)合用藥致B16F10細(xì)胞G1期阻滯，減少G2/M期

20 μmol·L-1紫檀茋和0.5 μmol·L-1乙酰紫草素單藥作用于細(xì)胞24 h后，檢測(cè)到G1期細(xì)胞比例分別為(67.3±2.5)%和(56.0±1.6)%，G2/M期細(xì)胞比例分別為(9.6±1.4)%和(10.3±3.5)%，紫檀茋可以引起細(xì)胞的G1期阻滯(P<0.05)。聯(lián)合用藥組G1期細(xì)胞比例為(72.9±2.4)%，G2/M期為(6.5±1.4)%，從中可以看到聯(lián)合用藥引起G1期明顯阻滯，與正常組相比差異有顯著性(P<0.01)，同時(shí)減少G2/M期細(xì)胞比例(P<0.05)，見(jiàn)Fig 6。

Fig 5　Pterostilbene, acetylshikonin and combination of both induced apoptosis in B16F10 cells(n=3)

*P<0.05vscontrol

3.

3.6RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的變化

20 μmol·L-1的紫檀茋和0.5 μmol·L-1乙酰紫草素分別處理B16F10細(xì)胞，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)p53、p21及Bax的mRNA的表達(dá)均逐漸增加，Cyclin E、CDK2、Bcl-2的mRNA的表達(dá)逐漸降低。聯(lián)合給藥組隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，p53、p21及Bax的mRNA的表達(dá)逐漸增加，Cyclin E、CDK2、Bcl-2的mRNA的表達(dá)逐漸降低，其中p53、Bax及Bcl-2表達(dá)差異大于單藥組(Fig 7)。

Fig 6　The cell cycle of B16F10 cells treated with acetylshikonin, pterostilbene and combination of both by flow±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01 treated groupvscontrol

3.7聯(lián)合用藥對(duì)皮內(nèi)黑色素移植瘤具有明顯的抑瘤作用

從Fig 8可知，環(huán)磷酰胺組的抑瘤率為67.2%，對(duì)黑色素移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。紫檀茋組和乙酰紫草素組的瘤塊大小明顯小于模型組，抑瘤率分別為13.4%和12.7%，聯(lián)合用藥組的瘤塊大小明顯小于任一單藥用藥組，抑瘤率為19.9%(P<0.05)。

4討論

惡性黑色素瘤是皮膚中產(chǎn)生的最嚴(yán)重的癌癥，其發(fā)病率也比其他癌癥更迅速，黑色素瘤的發(fā)病危險(xiǎn)系數(shù)與總體死亡率逐年上升，并對(duì)化療的反應(yīng)很差。近年來(lái)，天然產(chǎn)物以毒性低、藥源豐富等特點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。

馬錢(qián)子蜈蚣膏對(duì)皮膚癌有很好的療效，從中篩選出的紫檀茋(甲基化的茋類結(jié)構(gòu))具有抗炎、雌激素受體激動(dòng)等較出色生物活性，同時(shí)兼具較好的生物利用度和親脂性[4]，但是紫檀茋細(xì)胞毒活性低。另一個(gè)篩出的乙酰紫草素(萘醌結(jié)構(gòu))是紫草的主要活性成分[3,6]，細(xì)胞毒活性高，藥物毒性大。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫檀茋和乙酰紫草素均能有效地抑制B16F10細(xì)胞的增殖，協(xié)同作用效果更加明顯，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

通過(guò)TCMSP化合物-靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出紫檀茋和乙酰紫草素的相關(guān)靶點(diǎn)，紫檀茋有14個(gè)靶點(diǎn)與周期相關(guān)[14]，乙酰紫草素有12個(gè)靶點(diǎn)與凋亡相關(guān)[11]，同時(shí)這兩個(gè)化合物有13個(gè)靶點(diǎn)與p53通路相關(guān)[15-16]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)紫檀茋作用于B16F10細(xì)胞后，凋亡率沒(méi)有增加，而聯(lián)合用藥后凋亡率較單用藥組明顯升高，且有晚期凋亡的出現(xiàn)，這現(xiàn)象與增加了促凋亡基因Bax的表達(dá)，降低抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，紫檀茋這兩個(gè)基因的表達(dá)變化不明顯。同時(shí)聯(lián)合用藥可以引起G1期明顯阻滯，降低CDK2和Cyclin E基因的表達(dá)。

Fig 7　Expression of cell cycle progression and apoptosis related mRNA assessed by semi-quantitative RT-PCR.

Fig 8　Effects of pterostilbene, acetylshikonin and combination of both on carcinoma inhibition rate induced by melanoma(n=6).

*P<0.05,**P<0.01 treated groupvsmodel group

p53腫瘤抑制蛋白是一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控增殖、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和凋亡的細(xì)胞過(guò)程。細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及衰老是公認(rèn)的p53抑制腫瘤形成的主要機(jī)制[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知紫檀茋和乙酰紫草素的協(xié)同作用較好，推測(cè)其作用機(jī)制為通過(guò)激活p53信號(hào)通路，增加p53及p21基因的表達(dá)，誘導(dǎo)周期阻滯和凋亡。

在體內(nèi)黑色素移植瘤實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)紫檀茋和乙酰紫草素的共同給藥在一定程度上能抑制黑色素移植瘤的生長(zhǎng)。紫檀茋和乙酰紫草素在其抑制率較低的濃度共同給藥時(shí)，就能達(dá)到很好的抑制B16F10細(xì)胞增殖的效果，并具有一定協(xié)同作用，這有利于降低藥物的毒性反應(yīng)。紫檀茋和乙酰紫草素可通過(guò)改變細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，激活p53信號(hào)通路，從而產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，但對(duì)此機(jī)制仍需更深層次的研究。

(致謝：本研究在石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。衷心感謝導(dǎo)師張波老師和本課題研究中給予我關(guān)懷和支持的同學(xué)！)

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The synergistic antiproliferative effect of pterostilbene and acetylshikonin on B16F10 cells

CHEN Hong1,2,ZHANG Shan-shan1,2,DONG Jin-lei1,2,ZHONG Jing1,2, WANG Xiao-qin1, ZHANG Bo1,2

(1.SchoolofPharmaceutics; 2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

Abstract:AimTo evaluate the synergistic effect of anti-tumor by the pterostilbene and acetylshikonin acting on B16F10 cells and investigate the interrelated mechanisms.MethodsThe research screened and analyzed the target-related of pterostilbene and acetylshikonin by system-pharmacological methods. The proliferative inhibition rate of B16F10 cells were measured by MTT. The apoptosis in B16F10 cells were proved by both cellular morphological and biochemical methods. The expression of apoptotic genes were assessed via RT-PCR. The apoptotic rate and cell cycle were measured by flow cytometry. Melanoma models were established in C57BL/6 mice, and the inhibitory rate of tumor growth was measured.ResultsThe 14 targets of pterostilbene were closely related to cell cycle, acetylshikonin′s 12 targets displayed a relationship with apoptosis, and correlated with p53 signaling pathway. Pterostilbene along with acetylshikonin significantly inhibited cell proliferation of B16F10 cells in a dose-dependent way and resulted a remarkable synergistic effect. The apoptotic rate reached highest with a blocked-cell cycle at G1phase in the co-treatment group. The RT-PCR results showed that the expressions of p53, Bax and p21 were up-regulated and the expressions of Bcl-2, CDK2 and Cyclin E were down-regulated with time. The changes of p53, Bax and Bcl-2 were obvious in combined treated group. All treatmentsinvivoshowed different tumor inhibition rates while co-treatment group showed highest.ConclusionPterostilbene cooperated with acetylshikonin inhibits the proliferation in B16F10 cells, and activates the p53 signaling pathway to induce the B16F10 cells apoptosis and a cell cycle arrest.

Key words:melanoma; pterostilbene; acetylshikonin; drug combination; apoptosis; cell cycle; tumor inhibition rate

收稿日期：2016-01-06,修回稿日期：2016-02-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460566)；兵團(tuán)醫(yī)藥專項(xiàng)(No 2014BA029)；石河子大學(xué)對(duì)口支援高校名師“結(jié)對(duì)子”計(jì)劃資助(No SDJDZ201503)

作者簡(jiǎn)介：陳虹(1989-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail:541103537@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.016

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0818-07

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R284.1；R329.24；R329.25；R739.5

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.032.html

張波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系統(tǒng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:bozhang_lzu@126.com