培美曲塞二鈉中有關(guān)物質(zhì)HPLC檢測方法的改進

唐燕平，魏 佳

(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 211112)

培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)是一種胸苷酸合成酶/氫葉酸還原酶雙重抑制劑，結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團的抗葉酸制劑，能較強的破壞細胞內(nèi)葉酸依賴性正常代謝過程，抑制細胞復(fù)制，從而抑制腫瘤生長［1］。具有一定的骨髓抑制作用、腎毒性和腸道副反應(yīng)。目前已獲SFDA批準上市，用于惡性胸膜間皮瘤一線治療和非小細胞肺癌二線治療。在研究中發(fā)現(xiàn)，培美曲塞二鈉國家藥品標準中有關(guān)物質(zhì)檢查法［2，3］，無法同時檢查出所有雜質(zhì)及中間體，因此，我們對國家標準中規(guī)定的有關(guān)物質(zhì)檢查法進行優(yōu)化，不僅能夠有效的控制本品的有關(guān)物質(zhì)，而且也同樣適合粗品以及各步中間體的檢測，真實反映藥品的質(zhì)量，有助于發(fā)現(xiàn)目前產(chǎn)品中的質(zhì)量問題，進而促使產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

1 儀器及試藥

高效液相色譜儀1200型(美國 Agilent公司)，包括G1312二元泵，G1315D二極管陣列檢測器，G1316A柱溫箱，G1367B自動進樣器，G1322A在線脫氣機，ChemStation for LC 3D systems工作站(Rev.B.04.01)，德國賽多利斯 BP211D 電子分析天平。

培美曲塞二鈉對照品由南京海光應(yīng)用化學(xué)研究所提供，批號為20081001，含量 99.4%;培美曲塞二鈉3批(批號:090201、090202、090203)及原料對氨基苯甲酸、中間體有:Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氫 －4－氧代 －1H －吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氫－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰－L－谷氨酸二乙酯均由江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司提供;乙腈為色譜純，磷酸、磷酸銨為分析純;水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測定方法 色譜柱為Shim－Pack C18VPODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);以 0.02 mol·L－1磷酸銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0)為流動相A，乙腈為流動相B進行梯度洗脫(0～10 min，86∶14;10～25 min，40∶60;25～30 min，86∶14;30～35 min，86∶14)，稀釋液為流動相 A － 流動相B(86∶14)，流速 1.0 mL· min－1;檢測波長 240 nm，進樣體積:20 μL。

2.2 檢測波長的選擇 取培美曲塞二鈉及各中間體適量，用稀釋液溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 μg的溶液，取20 μL注入液相色譜儀，用Agilent 1200 Series DAD檢測器在190～400 nm范圍進行檢測，記錄色譜圖，發(fā)現(xiàn)在226 nm和240 nm波長下，培美曲塞二鈉有最大吸收，如用226 nm作檢測波長，雖然培美曲塞二鈉有明顯的特征吸收，但各中間體在此波長處吸收較弱，經(jīng)考察，采用240 nm作為檢測波長。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 各個雜質(zhì)的分離及最低檢測限 本品合成工藝中使用的原料是對氨基苯甲酸，中間體，Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基－4，7－二氫－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氫 －4－氧代 －1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰－L－谷氨酸二乙酯和培美曲塞二鈉各適量，用稀釋液配制成約10 μg·mL－1的混合溶液，按上述色譜條件進樣，結(jié)果見圖1－B，理論塔板數(shù)按培美曲塞二鈉峰計算大于5000，各已知物質(zhì)峰與培美曲塞二鈉峰之間的分離度均大于1.5。取上述溶液采用逐步稀釋的方法，得出培美曲塞二鈉及對氨基苯甲酸，Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基－4，7－二氫－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶 －5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氫 －4－氧代 －1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰 －L－谷氨酸二乙酯的檢測限分別為 0.5632，1.231，1.362，1.135，1.036，0.9154，0.8346 ng(S/N=3)。

2.3.2 強酸破壞試驗 精密稱取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液 2 mL，搖勻，于室溫放置 4 h后，用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，然后加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1－C。

2.3.3 強堿破壞試驗 精密稱取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加 0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，于室溫放置4 h后，用0.1 mol·L－1鹽酸溶液調(diào) pH 至中性，然后加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1－D。

2.3.4 氧化破壞試驗 精密稱取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加30%過氧化氫2 mL，搖勻，于室溫放置1 h后，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1－E。

圖1 專屬性試驗圖譜

2.3.5 熱破壞試驗 精密稱取本品12.5 mg，于 25 mL量瓶中，加水2 mL，搖勻，于水浴中加熱10 min后，取出，放冷至室溫，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1－F。

2.3.6 光破壞試驗 精密稱取本品12.5 mg，于 25 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，于4500 lx光照度下放置4 h后，取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1－G。

結(jié)果表明本品在強酸、強堿作用下較穩(wěn)定，在光照、高溫、氧化劑作用下發(fā)生不同程度的降解，且各條件下的降解產(chǎn)物峰與主成分峰均能達到良好的分離。故本色譜條件能滿足有關(guān)物質(zhì)考察的要求。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取培美曲塞二鈉對照品約50 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得培美曲塞二鈉對照品貯備液。

精密量取培美曲塞二鈉對照品儲備液 0.1、0.5、2.0、5.0、7.0、10.0 mL，分別置 20 mL 量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得 5，25，100，250，350，500 μg·mL－1的對照品溶液。分別取上述6種濃度的溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度C(μg·mL－1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸。回歸方程為A=5619.8C+19013;r=0.9999(n 0=3)。試驗結(jié)果表明，培美曲塞二鈉濃度在5.1～506.8 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 定量限檢測限 取培美曲塞二鈉對照品貯備液，以稀釋液逐級稀釋后進樣測定，按10∶1信噪比作檢測定量限，結(jié)果為1.5 ng;按3∶1信噪比作最低檢測限，結(jié)果為0.5 ng。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗 精密取培美曲塞二鈉(批號:090201)約25 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

取供試品溶液，室溫自然條件下放置，分別在 0，1，2，4，6，8 h取20 μL注入液相色譜儀進行測定，8 h內(nèi)峰面積沒有明顯變化，RSD為0.32%，表明培美曲塞二鈉供試溶液室溫自然放置在8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7 重復(fù)性試驗 取培美曲塞二鈉(批號:090201)約25 mg，6份，分別置50 mL量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取1 mL置100 mL量瓶中加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作對照溶液，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀進行測定，用自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)，平均為0.48%，RSD為1.89%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 有關(guān)物質(zhì)檢查 取本品適量，精密稱定，加稀釋液溶解并稀釋制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為供試品溶液;精密量取適量，加稀釋液稀釋制成每1 mL含5 μg的溶液，作為對照溶液。取對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%;精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的4.5倍。供試品溶液的色譜圖如有雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)的峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2倍(0.5%)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積(1%)(供試品溶液中的任何小于對照溶液主峰面積的0.01倍的峰可忽略不計)。

2.9 樣品測定 取培美曲塞二鈉樣品3批，按“有關(guān)物質(zhì)檢查”項下方法制備供試品溶液，測定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(%)

3 討論

3.1 取合成原料、中間體及成品適量，以流動相為溶劑，在190～450 nm掃描。結(jié)果表明成品在226 nm、240 nm波長處有明顯的特征吸收，但各個中間體在此波長處吸收較弱，而在240 nm波長處有最大吸收，因此綜合考慮，確定本品測定波長為240 nm。

3.2 流動相的選擇 本實驗考察了多種時間梯度洗脫程序，不是基線不容易穩(wěn)定，就是雜質(zhì)峰之間分離不好，運用本色譜條件不但主峰及雜質(zhì)峰出峰時間適宜，并能有效地分離各個雜質(zhì)峰及起始原料及中間體。經(jīng)破壞后的分解產(chǎn)物在此條件下也能有效地與主峰完全分離，最終確定了培美曲塞二鈉原料中有關(guān)物質(zhì)測定的色譜分析條件。

3.3 對藥品中相關(guān)物質(zhì)的控制是當前藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵，雖然HPLC法是最常用的檢測方法，但合理的HPLC系統(tǒng)是保證檢測結(jié)果具有可信度的前提。此外，對本品中有關(guān)物質(zhì)表征的正確與否，是能否真實反映藥品質(zhì)量的另一關(guān)鍵。本文將其各自原料藥的有關(guān)物質(zhì)控制方法，從色譜條件到質(zhì)控限度方面均相結(jié)合，所確定的分析系統(tǒng)有助于發(fā)現(xiàn)目前產(chǎn)品中的質(zhì)量問題，進而促使產(chǎn)品質(zhì)量的提高

［1］李樹婷，馬飛，孫燕.抗腫瘤代謝新藥－培美曲塞［J］.癌癥進展雜志，2005，3(5):68 －73.

［2］Hamilton CL，Kirkwood JA.Column － switching highperformance liquid chromatographic method for the determination ofa thymidylate synthase inhibitor，LY231514，all investigational agent for the treatment of solid tumors，in human plasma［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1994，654(2):297，303.

［3］陳寧，張根元，戈文蘭，等.培美曲塞二鈉中有關(guān)物質(zhì)的HPLC法測定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(3):214－215.