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    同種異體間充質(zhì)干細胞的成骨誘導(dǎo)聯(lián)合益骨湯治療骨缺損的研究

    2011-04-13 02:04:44哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院150001宋烜赫楊衛(wèi)良
    首都食品與醫(yī)藥 2011年6期
    關(guān)鍵詞:中藥

    哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院(150001)宋烜赫 楊衛(wèi)良

    骨缺損引起的相關(guān)疾病是嚴重影響人生活質(zhì)量和社會勞動力的常見病。長期以來,骨缺損修復(fù)都屬于重要的研究課題,迄今為止,臨床對創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的大范圍骨缺損的修復(fù)仍未得到有效的解決。人們嘗試過很多治療方法,但均存在一定的問題和缺陷。如自體骨的移植,其來源有限且對機體產(chǎn)生新的創(chuàng)傷,在臨床中很難實現(xiàn),意義不大;異體骨移植存在免疫排斥反應(yīng),影響治療效果;一般的人工合成替代物植入后常會引起感染、假體松動及異物反應(yīng)等并發(fā)癥。有材料表明,間充質(zhì)干細胞的抗原性較弱[1],如能以同種異體間充質(zhì)干細胞與組織工程材料相結(jié)合,在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)生成骨組織,將為骨缺損的治療開辟一個嶄新的領(lǐng)域。間充質(zhì)干細胞是具有多向分化功能的細胞,其在成體細胞中含量極少,但可以通過分離提純及擴增培養(yǎng)大量獲得,并在定向誘導(dǎo)劑的作用下向成骨方向轉(zhuǎn)化。本實驗鑒于上述情況開展了間充質(zhì)干細胞進行成骨誘導(dǎo)并治療骨缺損研究,希望能找到新的更合適的骨源,并在其基礎(chǔ)上進行自擬中藥復(fù)方益骨湯對骨缺損輔助治療作用的探討。

    1 材料和方法

    1.1 MSCs的分離培養(yǎng) 選取雄性大白兔,體重為2.5kg±500g。用含肝素30u/ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml加入含10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibsco公司)中,吹打混勻,置培養(yǎng)瓶中,37℃、5%C02、95%相對濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。5d后半量換液,1周后全部換液,以后每周換液2次,逐步去除未貼壁細胞。14d后貼壁細胞匯合到90%生長面積時,用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶2傳代,取第2代MSCs備用。

    1.2 MSCs纖維蛋白復(fù)合物的制備 取第2代細胞計數(shù)后制成5.0×106/ml的細胞懸液,按1∶1與纖維蛋白(醫(yī)用安可膠)混合,置12孔培養(yǎng)板、37℃孵育箱內(nèi)聚合1h,收縮過夜后備用。用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)3天,誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化。

    1.3 骨缺損模型的制作及處理 選用4~5個月齡清潔級雄性日本大耳兔20只(哈爾濱醫(yī)科大學動物中心提供),重2.5kg±500g。3%戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈麻醉,取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口顯露股骨髁, 用手鉆在股骨髁外側(cè)寬大處制作0.6cm×1.0cm的松質(zhì)骨缺損。沖洗干凈骨屑后,將同種異體MSCs復(fù)合物植入大白兔股骨缺損處。實驗組用益骨湯灌胃,按照人/兔體表面積換算服藥量,1次/d,對照組采用相同方法以蒸餾水替代中藥湯劑。術(shù)后不固定肢體,分籠飼養(yǎng),連續(xù)3 d使用青霉素預(yù)防感染。

    1.4 術(shù)后觀察 觀察動物的進食、活動和切口愈合情況。分別于術(shù)后8、12、16、24周進行骨密度測定及鏡下組織觀察,以了解骨缺損的修復(fù)。各期用空氣栓塞法處死動物5只,大體觀察缺損區(qū)修復(fù)情況,切取股骨標本,用10%中性福爾馬林溶液固定,脫鈣切片后HE染色,光鏡下觀察新生骨痂和骨缺損愈合情況。

    2 結(jié)果

    2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)情況 骨髓用淋巴細胞分離液分離出的細胞為較單一的圓球形細胞,倒置顯微鏡下觀察,見原代細胞培養(yǎng)24小時后大部分細胞貼壁生長,細胞逐漸從圓球形變成短梭形、長梭形,形態(tài)飽滿。72小時后貼壁細胞分裂增殖明顯,并逐漸形成細胞團、集落。以后集落不斷增大,相互匯合,約12d后細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。有些不貼壁的細胞,呈圓形,大部分隨換液除去。傳代約4小時后細胞開始貼壁,貼壁細胞呈梭形、多角形,傳代后細胞形態(tài)無明顯變化,但增殖速度加快。

    2.2 ALP測定結(jié)果 細胞經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后,ALP活性明顯增高,3天后實驗組即明顯高于對照組,隨后實驗組逐漸升高,8天左右達到高峰,其后稍有下降,但仍高于對照組。ALP測定結(jié)果提示經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞具有較強堿性磷酸酶活性。2.3 放射學檢查 實驗組:術(shù)后第8周骨缺損區(qū)兩斷端有少量骨痂形成;術(shù)后第12周骨缺損區(qū)兩斷端有大量模糊骨痂形成;術(shù)后第16周骨缺損區(qū)新骨密度增高,部分骨皮質(zhì)連續(xù);術(shù)后第24周骨缺損區(qū)新骨塑形好,骨皮質(zhì)連續(xù),新骨髓腔較通暢。對照組:術(shù)后第8周骨缺損區(qū)無明顯變化;術(shù)后第12周缺損區(qū)骨兩斷端出現(xiàn)少量骨痂陰影;術(shù)后第16周缺損區(qū)有模糊骨痂生長,骨痂向移植物長入;術(shù)后第24周缺損區(qū)骨痂生長逐漸增多,兩斷端連接不完全,新骨再生塑形差,髓腔未再通。

    3 討論

    MSCs是一種可以分化為多種中胚層細胞的成體干細胞,有證據(jù)表明MSCs具有體外成鈣、體內(nèi)成骨的能力。近年基于此的組織工程取得了諸多進展,主要表現(xiàn)在以自體骨髓MSCs為種子細胞復(fù)合不同載體修復(fù)各類骨缺損的實驗研究和初步的臨床應(yīng)用。但自體MSCs的回植須經(jīng)歷抽取骨髓、培養(yǎng)擴增及質(zhì)量控制檢測等階段[2],并且自體骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力隨著年齡的增加而減弱[3],不適合臨床應(yīng)用。

    Arinzen等[2]使用同種異體MSCs復(fù)合羥基磷灰石-磷酸三鈣成功修復(fù)了狗股骨的節(jié)段性骨缺損,并指出其修復(fù)效果與自體MSCs相似,明顯優(yōu)于無細胞植入組。骨缺損的研究多采用皮質(zhì)骨節(jié)段性骨缺損為模型,但也有研究員指出兔股骨髁0.6 cm×1.2 cm的松質(zhì)骨缺損不能自行愈合[4]。本實驗也支持這種觀點,兔股骨髁的松質(zhì)骨缺損模型是可行的。

    國內(nèi)外的許多學者也嘗試了中藥在骨折愈合中的作用并進行了大量的研究[5~8]。周重建[9]發(fā)現(xiàn),使用益氣化癖中藥能促進骨折斷端及其周圍毛細血管的開放量,而且多核巨噬細胞活性明顯增強。林燕萍也報道[10],服用煅狗骨后骨折處的血腫吸收和機化明顯快于對照組,認為煅狗骨具有活血通絡(luò)、健脾生肌的效應(yīng)。另有學者[11][12]發(fā)現(xiàn),肢傷三方(續(xù)斷、當歸、白芍、土鱉等)具有刺激大白兔骨折局部新生毛細血管網(wǎng)的形成,改善骨折局部的血液循環(huán),加快新陳代謝,強有力地刺激成骨細胞的活性。同時在骨折愈合處I型膠原表達增強。林潤臺[13]通過對骨折愈合過程中超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn),用丹參后成纖維細胞核仁有著邊、核凹陷的現(xiàn)象,特別是形成膠原的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。由此推測成纖維細胞蛋白質(zhì)合成旺盛,有利于產(chǎn)生更多的膠原纖維,促進骨折愈合。

    本實驗應(yīng)用益骨湯,其藥物組成為骨碎補、丹參、川牛膝、枸杞子、山藥、炒山楂、薄荷和陳皮。其中,骨碎補,味苦,性溫,入肝、腎經(jīng),功用補腎強骨,活血止血,續(xù)傷止痛,不但可治療腎陽不足之骨萎肉卻而治本,亦可活血通絡(luò)而治病之標。川牛膝,味苦、酸,性平,歸肝、腎經(jīng),功用活血通經(jīng)、引血下行、補肝腎、強筋骨、利水通淋。川牛膝之于治療骨蝕,亦屬于既能補遺強壯、又能活血通利的標本同治之品。枸杞子,味甘質(zhì)潤而性平,功用滋補肝腎、益精養(yǎng)血,長于治療腎精肝血不足所致髓枯骨殘。骨碎補和枸杞子,一療腎之元陽不足而冷痹骨萎,一療腎之陰精不充而髓枯骨萎,二者相互配合,共同切中腎虛骨萎的核心病機。丹參,味苦而性微寒,可活血通痹?!秳e錄》稱其主“腰脊強、腳痹”,亦以清通氣血之功,而能除血瘀血熱、宣絡(luò)蠲痹,治療骨節(jié)疼痛、四肢不遂,亦可助諸般補益肝腎之品達于病所,而收治療骨萎之功。山藥,味甘,性平,歸脾、肺、腎經(jīng),功用益氣養(yǎng)陰、補脾肺腎。其具備的補中益氣而溫養(yǎng)肌肉與益腎固精而療腎虛腰痛的雙重功效,使其成為治療骨萎之證所必須。陳皮,味苦辛而性溫,歸脾、肺經(jīng),可理氣健脾、祛濕消痰。蓋脾氣健運,氣機調(diào)暢,經(jīng)絡(luò)痰濕得消,則可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。炒山揸,味酸、甘,性微溫,歸脾、胃、肝經(jīng),功效消食化積、行氣散瘀,亦可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。薄荷,味辛,性涼,歸肺、肝經(jīng),其力能內(nèi)透筋骨、外達肌表、宣通臟腑、貫串經(jīng)絡(luò)。故對于肝失調(diào)達、肝氣郁結(jié)所致之氣血阻滯、骨髓脈絡(luò)失養(yǎng)之病機,以薄荷最宜。

    在中藥對于細胞及生長因子的調(diào)節(jié)機制研究中,林燕萍[10][14][15]等發(fā)現(xiàn),煅狗骨促進垂體TSH細胞功能的同時也促進OH細胞功能,促進甲狀腺素的分泌,并認為鍛狗骨可能通過甲狀腺激素和生長激素的直接或間接作用,刺激骨折斷端的成骨細胞和破骨細胞的活性,促進新生骨小梁的形成,最終促進骨折的愈合。劉獻祥[15]用免疫組化技術(shù)進行圖像定量分析的結(jié)果表明,中藥(補腎復(fù)方)能明顯提高骨折模型家兔骨折處骨癡DNA指數(shù)和BMP含量,促進和誘導(dǎo)BMP的合成,加速骨折愈合。

    本實驗相同時期實驗組與對照組相比有明顯改變:①中藥治療組明顯促進和縮短骨缺損修復(fù)時間;②使用中藥治療后血腫吸收和機化時間明顯縮短;③服用中藥期間,間充質(zhì)細胞呈梭形改變明顯,骨核細胞濃縮,染色質(zhì)凝聚靠邊,有大量的膠原纖維,細胞質(zhì)容量的增加,特別是形成膠原纖維的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。結(jié)果表明,同種異體間充質(zhì)干細胞的成骨誘導(dǎo)輔以中藥益骨湯治療骨缺損,不但能有效縮短病程,提高患者生活質(zhì)量,減輕患者痛苦,而且中醫(yī)的辨證論治方法可以實現(xiàn)真正的個體化治療,即針對不同人群的不同體質(zhì)骨破損后產(chǎn)生的不同癥狀遣方用藥,避免了重復(fù)用藥的弊端。此外,中藥制劑方便易尋,價格低廉,便于推廣應(yīng)用。

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