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    同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)聯(lián)合益骨湯治療骨缺損的研究

    2011-04-13 02:04:44哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院150001宋烜赫楊衛(wèi)良
    首都食品與醫(yī)藥 2011年6期
    關(guān)鍵詞:中藥

    哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(150001)宋烜赫 楊衛(wèi)良

    骨缺損引起的相關(guān)疾病是嚴(yán)重影響人生活質(zhì)量和社會勞動力的常見病。長期以來,骨缺損修復(fù)都屬于重要的研究課題,迄今為止,臨床對創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的大范圍骨缺損的修復(fù)仍未得到有效的解決。人們嘗試過很多治療方法,但均存在一定的問題和缺陷。如自體骨的移植,其來源有限且對機(jī)體產(chǎn)生新的創(chuàng)傷,在臨床中很難實現(xiàn),意義不大;異體骨移植存在免疫排斥反應(yīng),影響治療效果;一般的人工合成替代物植入后常會引起感染、假體松動及異物反應(yīng)等并發(fā)癥。有材料表明,間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原性較弱[1],如能以同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞與組織工程材料相結(jié)合,在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)生成骨組織,將為骨缺損的治療開辟一個嶄新的領(lǐng)域。間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化功能的細(xì)胞,其在成體細(xì)胞中含量極少,但可以通過分離提純及擴(kuò)增培養(yǎng)大量獲得,并在定向誘導(dǎo)劑的作用下向成骨方向轉(zhuǎn)化。本實驗鑒于上述情況開展了間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)并治療骨缺損研究,希望能找到新的更合適的骨源,并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行自擬中藥復(fù)方益骨湯對骨缺損輔助治療作用的探討。

    1 材料和方法

    1.1 MSCs的分離培養(yǎng) 選取雄性大白兔,體重為2.5kg±500g。用含肝素30u/ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml加入含10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibsco公司)中,吹打混勻,置培養(yǎng)瓶中,37℃、5%C02、95%相對濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。5d后半量換液,1周后全部換液,以后每周換液2次,逐步去除未貼壁細(xì)胞。14d后貼壁細(xì)胞匯合到90%生長面積時,用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶2傳代,取第2代MSCs備用。

    1.2 MSCs纖維蛋白復(fù)合物的制備 取第2代細(xì)胞計數(shù)后制成5.0×106/ml的細(xì)胞懸液,按1∶1與纖維蛋白(醫(yī)用安可膠)混合,置12孔培養(yǎng)板、37℃孵育箱內(nèi)聚合1h,收縮過夜后備用。用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)3天,誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化。

    1.3 骨缺損模型的制作及處理 選用4~5個月齡清潔級雄性日本大耳兔20只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心提供),重2.5kg±500g。3%戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈麻醉,取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口顯露股骨髁, 用手鉆在股骨髁外側(cè)寬大處制作0.6cm×1.0cm的松質(zhì)骨缺損。沖洗干凈骨屑后,將同種異體MSCs復(fù)合物植入大白兔股骨缺損處。實驗組用益骨湯灌胃,按照人/兔體表面積換算服藥量,1次/d,對照組采用相同方法以蒸餾水替代中藥湯劑。術(shù)后不固定肢體,分籠飼養(yǎng),連續(xù)3 d使用青霉素預(yù)防感染。

    1.4 術(shù)后觀察 觀察動物的進(jìn)食、活動和切口愈合情況。分別于術(shù)后8、12、16、24周進(jìn)行骨密度測定及鏡下組織觀察,以了解骨缺損的修復(fù)。各期用空氣栓塞法處死動物5只,大體觀察缺損區(qū)修復(fù)情況,切取股骨標(biāo)本,用10%中性福爾馬林溶液固定,脫鈣切片后HE染色,光鏡下觀察新生骨痂和骨缺損愈合情況。

    2 結(jié)果

    2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)情況 骨髓用淋巴細(xì)胞分離液分離出的細(xì)胞為較單一的圓球形細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察,見原代細(xì)胞培養(yǎng)24小時后大部分細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞逐漸從圓球形變成短梭形、長梭形,形態(tài)飽滿。72小時后貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯,并逐漸形成細(xì)胞團(tuán)、集落。以后集落不斷增大,相互匯合,約12d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。有些不貼壁的細(xì)胞,呈圓形,大部分隨換液除去。傳代約4小時后細(xì)胞開始貼壁,貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形,傳代后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,但增殖速度加快。

    2.2 ALP測定結(jié)果 細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后,ALP活性明顯增高,3天后實驗組即明顯高于對照組,隨后實驗組逐漸升高,8天左右達(dá)到高峰,其后稍有下降,但仍高于對照組。ALP測定結(jié)果提示經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞具有較強(qiáng)堿性磷酸酶活性。2.3 放射學(xué)檢查 實驗組:術(shù)后第8周骨缺損區(qū)兩斷端有少量骨痂形成;術(shù)后第12周骨缺損區(qū)兩斷端有大量模糊骨痂形成;術(shù)后第16周骨缺損區(qū)新骨密度增高,部分骨皮質(zhì)連續(xù);術(shù)后第24周骨缺損區(qū)新骨塑形好,骨皮質(zhì)連續(xù),新骨髓腔較通暢。對照組:術(shù)后第8周骨缺損區(qū)無明顯變化;術(shù)后第12周缺損區(qū)骨兩斷端出現(xiàn)少量骨痂陰影;術(shù)后第16周缺損區(qū)有模糊骨痂生長,骨痂向移植物長入;術(shù)后第24周缺損區(qū)骨痂生長逐漸增多,兩斷端連接不完全,新骨再生塑形差,髓腔未再通。

    3 討論

    MSCs是一種可以分化為多種中胚層細(xì)胞的成體干細(xì)胞,有證據(jù)表明MSCs具有體外成鈣、體內(nèi)成骨的能力。近年基于此的組織工程取得了諸多進(jìn)展,主要表現(xiàn)在以自體骨髓MSCs為種子細(xì)胞復(fù)合不同載體修復(fù)各類骨缺損的實驗研究和初步的臨床應(yīng)用。但自體MSCs的回植須經(jīng)歷抽取骨髓、培養(yǎng)擴(kuò)增及質(zhì)量控制檢測等階段[2],并且自體骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力隨著年齡的增加而減弱[3],不適合臨床應(yīng)用。

    Arinzen等[2]使用同種異體MSCs復(fù)合羥基磷灰石-磷酸三鈣成功修復(fù)了狗股骨的節(jié)段性骨缺損,并指出其修復(fù)效果與自體MSCs相似,明顯優(yōu)于無細(xì)胞植入組。骨缺損的研究多采用皮質(zhì)骨節(jié)段性骨缺損為模型,但也有研究員指出兔股骨髁0.6 cm×1.2 cm的松質(zhì)骨缺損不能自行愈合[4]。本實驗也支持這種觀點,兔股骨髁的松質(zhì)骨缺損模型是可行的。

    國內(nèi)外的許多學(xué)者也嘗試了中藥在骨折愈合中的作用并進(jìn)行了大量的研究[5~8]。周重建[9]發(fā)現(xiàn),使用益氣化癖中藥能促進(jìn)骨折斷端及其周圍毛細(xì)血管的開放量,而且多核巨噬細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。林燕萍也報道[10],服用煅狗骨后骨折處的血腫吸收和機(jī)化明顯快于對照組,認(rèn)為煅狗骨具有活血通絡(luò)、健脾生肌的效應(yīng)。另有學(xué)者[11][12]發(fā)現(xiàn),肢傷三方(續(xù)斷、當(dāng)歸、白芍、土鱉等)具有刺激大白兔骨折局部新生毛細(xì)血管網(wǎng)的形成,改善骨折局部的血液循環(huán),加快新陳代謝,強(qiáng)有力地刺激成骨細(xì)胞的活性。同時在骨折愈合處I型膠原表達(dá)增強(qiáng)。林潤臺[13]通過對骨折愈合過程中超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn),用丹參后成纖維細(xì)胞核仁有著邊、核凹陷的現(xiàn)象,特別是形成膠原的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。由此推測成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)合成旺盛,有利于產(chǎn)生更多的膠原纖維,促進(jìn)骨折愈合。

    本實驗應(yīng)用益骨湯,其藥物組成為骨碎補(bǔ)、丹參、川牛膝、枸杞子、山藥、炒山楂、薄荷和陳皮。其中,骨碎補(bǔ),味苦,性溫,入肝、腎經(jīng),功用補(bǔ)腎強(qiáng)骨,活血止血,續(xù)傷止痛,不但可治療腎陽不足之骨萎肉卻而治本,亦可活血通絡(luò)而治病之標(biāo)。川牛膝,味苦、酸,性平,歸肝、腎經(jīng),功用活血通經(jīng)、引血下行、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利水通淋。川牛膝之于治療骨蝕,亦屬于既能補(bǔ)遺強(qiáng)壯、又能活血通利的標(biāo)本同治之品。枸杞子,味甘質(zhì)潤而性平,功用滋補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血,長于治療腎精肝血不足所致髓枯骨殘。骨碎補(bǔ)和枸杞子,一療腎之元陽不足而冷痹骨萎,一療腎之陰精不充而髓枯骨萎,二者相互配合,共同切中腎虛骨萎的核心病機(jī)。丹參,味苦而性微寒,可活血通痹?!秳e錄》稱其主“腰脊強(qiáng)、腳痹”,亦以清通氣血之功,而能除血瘀血熱、宣絡(luò)蠲痹,治療骨節(jié)疼痛、四肢不遂,亦可助諸般補(bǔ)益肝腎之品達(dá)于病所,而收治療骨萎之功。山藥,味甘,性平,歸脾、肺、腎經(jīng),功用益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎。其具備的補(bǔ)中益氣而溫養(yǎng)肌肉與益腎固精而療腎虛腰痛的雙重功效,使其成為治療骨萎之證所必須。陳皮,味苦辛而性溫,歸脾、肺經(jīng),可理氣健脾、祛濕消痰。蓋脾氣健運,氣機(jī)調(diào)暢,經(jīng)絡(luò)痰濕得消,則可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。炒山揸,味酸、甘,性微溫,歸脾、胃、肝經(jīng),功效消食化積、行氣散瘀,亦可助精微消化、吸收、布散以調(diào)治骨萎。薄荷,味辛,性涼,歸肺、肝經(jīng),其力能內(nèi)透筋骨、外達(dá)肌表、宣通臟腑、貫串經(jīng)絡(luò)。故對于肝失調(diào)達(dá)、肝氣郁結(jié)所致之氣血阻滯、骨髓脈絡(luò)失養(yǎng)之病機(jī),以薄荷最宜。

    在中藥對于細(xì)胞及生長因子的調(diào)節(jié)機(jī)制研究中,林燕萍[10][14][15]等發(fā)現(xiàn),煅狗骨促進(jìn)垂體TSH細(xì)胞功能的同時也促進(jìn)OH細(xì)胞功能,促進(jìn)甲狀腺素的分泌,并認(rèn)為鍛狗骨可能通過甲狀腺激素和生長激素的直接或間接作用,刺激骨折斷端的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)新生骨小梁的形成,最終促進(jìn)骨折的愈合。劉獻(xiàn)祥[15]用免疫組化技術(shù)進(jìn)行圖像定量分析的結(jié)果表明,中藥(補(bǔ)腎復(fù)方)能明顯提高骨折模型家兔骨折處骨癡DNA指數(shù)和BMP含量,促進(jìn)和誘導(dǎo)BMP的合成,加速骨折愈合。

    本實驗相同時期實驗組與對照組相比有明顯改變:①中藥治療組明顯促進(jìn)和縮短骨缺損修復(fù)時間;②使用中藥治療后血腫吸收和機(jī)化時間明顯縮短;③服用中藥期間,間充質(zhì)細(xì)胞呈梭形改變明顯,骨核細(xì)胞濃縮,染色質(zhì)凝聚靠邊,有大量的膠原纖維,細(xì)胞質(zhì)容量的增加,特別是形成膠原纖維的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量增加。結(jié)果表明,同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)輔以中藥益骨湯治療骨缺損,不但能有效縮短病程,提高患者生活質(zhì)量,減輕患者痛苦,而且中醫(yī)的辨證論治方法可以實現(xiàn)真正的個體化治療,即針對不同人群的不同體質(zhì)骨破損后產(chǎn)生的不同癥狀遣方用藥,避免了重復(fù)用藥的弊端。此外,中藥制劑方便易尋,價格低廉,便于推廣應(yīng)用。

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