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    牛黃消炎片微生物限度檢查方法探討

    2011-10-30 04:13:36江蘇省泰州市藥品檢驗(yàn)所225300季大偉錢桂英
    首都食品與醫(yī)藥 2011年6期
    關(guān)鍵詞:牛黃方法

    江蘇省泰州市藥品檢驗(yàn)所(225300)季大偉 錢桂英

    藥理實(shí)驗(yàn)證明,牛黃消炎片主要成分大黃和人工牛黃對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用?!吨袊幍洹?005年版規(guī)定,具有抑菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)必須消除供試液的抑菌活性后再依法檢查。然而,本研究在日常監(jiān)督檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),僅牛黃消炎片一個(gè)品種,不同的生產(chǎn)單位在進(jìn)行微生物限度細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查時(shí),采用的消除供試液抑菌活性的方法各不相同,給基層監(jiān)督檢驗(yàn)工作帶來很大困難。本研究旨在對由7個(gè)生產(chǎn)單位涉及常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法及薄膜過濾法的牛黃消炎片細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查方法按《中國藥典》2005年版規(guī)定進(jìn)行再驗(yàn)證,促進(jìn)以品種確定方法工作的開展。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器 HTY-760勻漿儀,PL202-L便攜式電子天平,0412-1型離心機(jī)。

    1.2 試劑 培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;稀釋劑:pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(稀釋供試品用),0.9%無菌氯化鈉溶液(稀釋菌液用)。

    1.3 菌種 大腸埃希菌Escherichia coli[C M C C(B)4 4 1 0 2],金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501],由中國藥品生物制品檢驗(yàn)所提供,傳代次數(shù)均為三代。樣品信息見附表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試液制備 稱取供試品10g,加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀粉碎,混勻,作為1:10的供試液。

    2.2 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18~24h,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50~100cfu的菌懸液,備用。2.3 回收率試驗(yàn)方法 試驗(yàn)組:①常規(guī)法:取供試液1ml和50~100cfu試驗(yàn)菌同時(shí)加入平皿中,立即傾注15ml~20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,按規(guī)定培養(yǎng),菌落計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備兩個(gè)平皿。②培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml?皿-1):取供試液1ml按每一平皿0.2ml分置5個(gè)平皿中,每一平皿分別加入50~100cfu試驗(yàn)菌。③離心沉淀集菌、薄膜過濾聯(lián)用法:取供試液10ml置離心管中,500RPM×3min離心后取全部上清液置無菌試管中,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補(bǔ)足10ml,再從中取1ml,加適量稀釋劑,依法按薄膜過濾法處理,沖洗量500ml(100ml×5次)。

    2.3.2 菌液組 測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

    2.3.3 供試品對照組 除不加試驗(yàn)菌外,其余操作同試驗(yàn)組,測定本底菌數(shù)。

    2.3.4 回收率(%)=(試驗(yàn)組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

    2.4 方法的確立 為了解樣品的抑菌活性情況,采用常規(guī)法進(jìn)行回收率試驗(yàn),根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確定消除抑菌活性的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見附表2。由附表2可知,7個(gè)樣品的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的回收率均大于70%;除3號樣品外,其他6個(gè)樣品的枯草芽孢桿菌回收率均低于70%,不能采用常規(guī)法進(jìn)行樣品細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查,故無法把細(xì)菌計(jì)數(shù)方法統(tǒng)一為常規(guī)法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用②法進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果見附表3。由附表3可知,采用②法,除2、3號樣品外,其他5個(gè)樣品的金黃色葡萄球菌回收率均低于70%,不能采用②法進(jìn)行樣品細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查,故無法把細(xì)菌計(jì)數(shù)方法統(tǒng)一為培養(yǎng)基稀釋法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用③法進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果見附表3。由附表4可見,采用③法,所有供試品的金黃色葡萄球菌回收率均高于70%。

    2.4 方法的驗(yàn)證 采用③法進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。由附表5可見,3次平行試驗(yàn)回收率均大于70%,表明該法能有效消除牛黃消炎片抑菌作用,可將牛黃消炎片細(xì)菌計(jì)數(shù)方法統(tǒng)一為離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。

    3 結(jié)果與結(jié)論

    微生物限度檢查方法:細(xì)菌計(jì)數(shù)采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法,霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)及控制菌檢查均采用常規(guī)法。

    4 討論

    4.1 根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)提供的驗(yàn)證資料,5號樣品采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。對于需要離心沉淀特殊處理的供試品,《中國藥典》2005年版規(guī)定應(yīng)增加稀釋劑對照組,且在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中,稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。在試驗(yàn)中,稀釋劑對照組按上述方法處理后,其菌回收率存在較大偏差,離心處理對細(xì)菌回收影響較大,尤其是金黃色葡萄球菌。有文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)菌菌體本身易吸附于大于20μm的微粒上,因此,《中國藥典》2010年版明確規(guī)定,離心沉淀集菌法僅適用于微生物限度檢查供試液的制備,并且應(yīng)盡量避免使用,且不可使用快速離心。為此將兩次離心修改為一次離心:500RPM離心,不超過3分鐘。由試驗(yàn)可知,按500RPM離心5min后取上清液棄沉淀的處理方式會(huì)把吸附于供試品中的細(xì)菌、霉菌和酵母菌隨沉淀一同棄去,導(dǎo)致回收率達(dá)不到要求,從而離心沉淀集菌法是一種需改進(jìn)的方法。

    附表1 樣品信息

    附表2 常規(guī)法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

    附表3 枯草芽孢桿菌按②法回收率試驗(yàn)結(jié)果

    附表4 枯草芽孢桿菌按③法回收率試驗(yàn)結(jié)果

    附表5 3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    4.2 全國已有生產(chǎn)批準(zhǔn)文號的牛黃消炎片58個(gè)。由于地域原因,本研究只能采集到7個(gè)生產(chǎn)廠家的樣品進(jìn)行試驗(yàn),但本次試驗(yàn)樣品的驗(yàn)證資料中囊括了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法和薄膜過濾法,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有了代表性。

    4.3 目前《中國藥典》2010年版已對若干個(gè)品種的微生物限度檢查方法做出統(tǒng)一規(guī)定,足以表明以品種建立微生物限度檢查方法已經(jīng)受到重視。本研究對牛黃消炎片的微生物限度檢查方法進(jìn)行了探討性試驗(yàn),為新版藥典的修訂提供了數(shù)據(jù)支持。

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