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    牛黃消炎片微生物限度檢查方法探討

    2011-10-30 04:13:36江蘇省泰州市藥品檢驗所225300季大偉錢桂英
    首都食品與醫(yī)藥 2011年6期
    關(guān)鍵詞:牛黃方法

    江蘇省泰州市藥品檢驗所(225300)季大偉 錢桂英

    藥理實驗證明,牛黃消炎片主要成分大黃和人工牛黃對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用?!吨袊幍洹?005年版規(guī)定,具有抑菌活性的藥品進行微生物限度檢查時必須消除供試液的抑菌活性后再依法檢查。然而,本研究在日常監(jiān)督檢驗中發(fā)現(xiàn),僅牛黃消炎片一個品種,不同的生產(chǎn)單位在進行微生物限度細菌計數(shù)檢查時,采用的消除供試液抑菌活性的方法各不相同,給基層監(jiān)督檢驗工作帶來很大困難。本研究旨在對由7個生產(chǎn)單位涉及常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法及薄膜過濾法的牛黃消炎片細菌計數(shù)檢查方法按《中國藥典》2005年版規(guī)定進行再驗證,促進以品種確定方法工作的開展。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器 HTY-760勻漿儀,PL202-L便攜式電子天平,0412-1型離心機。

    1.2 試劑 培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;稀釋劑:pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(稀釋供試品用),0.9%無菌氯化鈉溶液(稀釋菌液用)。

    1.3 菌種 大腸埃希菌Escherichia coli[C M C C(B)4 4 1 0 2],金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501],由中國藥品生物制品檢驗所提供,傳代次數(shù)均為三代。樣品信息見附表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試液制備 稱取供試品10g,加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀粉碎,混勻,作為1:10的供試液。

    2.2 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18~24h,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50~100cfu的菌懸液,備用。2.3 回收率試驗方法 試驗組:①常規(guī)法:取供試液1ml和50~100cfu試驗菌同時加入平皿中,立即傾注15ml~20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,按規(guī)定培養(yǎng),菌落計數(shù)。每株試驗菌平行制備兩個平皿。②培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml?皿-1):取供試液1ml按每一平皿0.2ml分置5個平皿中,每一平皿分別加入50~100cfu試驗菌。③離心沉淀集菌、薄膜過濾聯(lián)用法:取供試液10ml置離心管中,500RPM×3min離心后取全部上清液置無菌試管中,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補足10ml,再從中取1ml,加適量稀釋劑,依法按薄膜過濾法處理,沖洗量500ml(100ml×5次)。

    2.3.2 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。

    2.3.3 供試品對照組 除不加試驗菌外,其余操作同試驗組,測定本底菌數(shù)。

    2.3.4 回收率(%)=(試驗組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

    2.4 方法的確立 為了解樣品的抑菌活性情況,采用常規(guī)法進行回收率試驗,根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,確定消除抑菌活性的方法并進行驗證。預(yù)試驗結(jié)果見附表2。由附表2可知,7個樣品的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的回收率均大于70%;除3號樣品外,其他6個樣品的枯草芽孢桿菌回收率均低于70%,不能采用常規(guī)法進行樣品細菌計數(shù)檢查,故無法把細菌計數(shù)方法統(tǒng)一為常規(guī)法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用②法進行回收率試驗,結(jié)果見附表3。由附表3可知,采用②法,除2、3號樣品外,其他5個樣品的金黃色葡萄球菌回收率均低于70%,不能采用②法進行樣品細菌計數(shù)檢查,故無法把細菌計數(shù)方法統(tǒng)一為培養(yǎng)基稀釋法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用③法進行回收率試驗,結(jié)果見附表3。由附表4可見,采用③法,所有供試品的金黃色葡萄球菌回收率均高于70%。

    2.4 方法的驗證 采用③法進行3次獨立的平行試驗。由附表5可見,3次平行試驗回收率均大于70%,表明該法能有效消除牛黃消炎片抑菌作用,可將牛黃消炎片細菌計數(shù)方法統(tǒng)一為離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。

    3 結(jié)果與結(jié)論

    微生物限度檢查方法:細菌計數(shù)采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法,霉菌和酵母菌計數(shù)及控制菌檢查均采用常規(guī)法。

    4 討論

    4.1 根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)提供的驗證資料,5號樣品采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。對于需要離心沉淀特殊處理的供試品,《中國藥典》2005年版規(guī)定應(yīng)增加稀釋劑對照組,且在3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。在試驗中,稀釋劑對照組按上述方法處理后,其菌回收率存在較大偏差,離心處理對細菌回收影響較大,尤其是金黃色葡萄球菌。有文獻報道,細菌菌體本身易吸附于大于20μm的微粒上,因此,《中國藥典》2010年版明確規(guī)定,離心沉淀集菌法僅適用于微生物限度檢查供試液的制備,并且應(yīng)盡量避免使用,且不可使用快速離心。為此將兩次離心修改為一次離心:500RPM離心,不超過3分鐘。由試驗可知,按500RPM離心5min后取上清液棄沉淀的處理方式會把吸附于供試品中的細菌、霉菌和酵母菌隨沉淀一同棄去,導(dǎo)致回收率達不到要求,從而離心沉淀集菌法是一種需改進的方法。

    附表1 樣品信息

    附表2 常規(guī)法預(yù)試驗結(jié)果

    附表3 枯草芽孢桿菌按②法回收率試驗結(jié)果

    附表4 枯草芽孢桿菌按③法回收率試驗結(jié)果

    附表5 3次平行驗證試驗結(jié)果

    4.2 全國已有生產(chǎn)批準文號的牛黃消炎片58個。由于地域原因,本研究只能采集到7個生產(chǎn)廠家的樣品進行試驗,但本次試驗樣品的驗證資料中囊括了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法和薄膜過濾法,使實驗結(jié)果具有了代表性。

    4.3 目前《中國藥典》2010年版已對若干個品種的微生物限度檢查方法做出統(tǒng)一規(guī)定,足以表明以品種建立微生物限度檢查方法已經(jīng)受到重視。本研究對牛黃消炎片的微生物限度檢查方法進行了探討性試驗,為新版藥典的修訂提供了數(shù)據(jù)支持。

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