枯草芽孢桿菌產凝乳酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁明亮，歐陽安然，王望斐，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽

枯草芽孢桿菌產凝乳酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁明亮，歐陽安然，王望斐，顧正華，丁重陽*，張 梁，石貴陽

(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

為進一步提高枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)液態(tài)發(fā)酵產凝乳酶(milking-clotting enzyme，MCE)的能力，采用單因素試驗和響應曲面法對枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的產酶條件進行研究和優(yōu)化。結果表明：最優(yōu)發(fā)酵工藝為：葡萄糖添加量16.2g/L，在500mL三角瓶中裝53.3mL料液，接種量為體積分數(shù)0.130%，發(fā)酵時間120.43h，預測酶活力為1097.30SU/mL，經實驗驗證，在該條件下發(fā)酵產凝乳酶的酶活力為(1129.05±74.55)SU/mL，與模型預測值相符。

凝乳酶；枯草芽孢桿菌； 液態(tài)發(fā)酵； 響應曲面法； 優(yōu)化

凝乳酶是乳酪生產中的關鍵酶，傳統(tǒng)上利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，隨著乳酪產業(yè)不斷擴大，單純靠宰殺幼畜的方法來生產凝乳酶已經不能滿足現(xiàn)代工業(yè)對凝乳酶的需求[1]。20世紀50年代以來，研究者一直努力尋求新的凝乳酶來源[2]，目前除動物凝乳酶外，還有植物凝乳酶(無花果樹液和菠蘿果實[3])和微生物凝乳酶(主要來源于真菌[4])。微生物的生長特性使得微生物凝乳酶具有廣闊的發(fā)展前景[5]，但關于微生物凝乳酶的研究主要集中在米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的固態(tài)發(fā)酵產酶方面，關于細菌液態(tài)發(fā)酵的研究報道較少。細菌較絲狀真菌，具有生長周期短、生產成本低、易于控制生長條件等優(yōu)點，近幾年得到研究者更多的關注。

本課題組前期研究篩選得到了1株具有較高產酶能力的細菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在此基礎上，本實驗研究影響此株枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產凝乳酶的相關因素，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化并對該條件下發(fā)酵產凝乳酶的酶活力進行測定。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

本實驗室篩選保藏的1株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

脫脂奶粉 黑龍江省光明松鶴乳品有限責任公司；麩皮由無錫市青山市場購得，并經JFSD-100-Ⅱ型粉碎機(上海嘉定糧儀有限公司，配有30目篩)粉碎。

1.2 培養(yǎng)基、試劑與儀器

斜面種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、酵母膏10、瓊脂條20、pH值自然，115℃滅菌20min；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麩皮 30、NaCl 5、MgSO4·7H2O 5、KH2PO42、CaCO33、pH值自然，121℃滅菌30min。

氯化鈣、氯化鈉、MgSO4·7H2O、磷酸二氫鉀、碳酸鈣 國藥集團化學試劑有限公司。

DKB-8A型水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；DKY-Ⅱ型恒溫調速回轉式搖床 上海杜科自動化設備有限公司。

1.3 方法

種子液于35℃、150r/min培養(yǎng)24h。發(fā)酵產凝乳酶的培養(yǎng)條件根據(jù)具體實驗設計改變各參數(shù)的變量。單因素試驗中，葡萄糖質量濃度依次采用0、20、40、60g/L；500mL三角瓶中的裝液量依次采用40、60、80、100mL；接種量依次采用0.0125%、0.025%、0.0625%、0.125%；發(fā)酵時間依次采用24、48、72、96、120、144h。基于單因素試驗，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量、裝液量、接種量和發(fā)酵時間對凝乳酶活力的影響，借助于Design-Expert7.1.6，采用全因子中心組合設計(Full-factorial CCD)[6]對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，求得響應值與各因子的回歸方程并進行實驗驗證。

采用Arima法進行凝乳酶活力的測定[7]：用0.01mol/L氯化鈣溶液配制12%脫脂奶粉溶液，室溫放置40min后使用，當天配制。取5mL 12%的脫脂奶粉溶液在35℃水浴鍋中保溫10min，加0.05mL酶液，立即搖勻，開始計時，把試管傾斜45°，旋轉試管，觀察壁上出現(xiàn)絮狀沉淀時為凝乳終點，記錄凝乳時間。40min凝固1mL脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxhlet unit，SU)。按下式計算凝乳酶活力。

式中：MCE為凝乳酶活力/(SU/mL)；V1為脫脂牛奶溶液體積/mL；t為凝乳時間/s；V2為加酶體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質量濃度對酶活力的影響

圖1 葡萄糖質量濃度對凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of glucose on the MCE activity

由圖1可見，葡萄糖質量濃度對凝乳酶活力呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象：葡萄糖質量濃度為0～40g/L時，凝乳酶活力隨葡萄糖質量濃度的增加而緩慢升高，當葡萄糖添加量為40g/L時酶活力達最高值402SU/mL；葡萄糖質量濃度為40g/L以上時，凝乳酶活力隨葡萄糖質量濃度的增加明顯下降。

圖2 裝液量對凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of liquid volume on the MCE activity

2.2 發(fā)酵瓶裝液量對凝乳酶活力的影響該枯草芽孢桿菌產凝乳酶的發(fā)酵過程對氧有著一定的需求量。由圖2可見，裝液量為60mL/500mL時獲得最高酶活力568SU/mL，再增加裝液量，酶活力會迅速下降，當裝液量大于80mL/500mL時，酶活力下降速率減慢，溶氧的減少對產酶不利。

2.3 發(fā)酵接種量對凝乳酶活力的影響

圖3 接種量對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of inoculums size on the MCE activity

由圖3可見，隨接種量的增加，酶活力不斷增強；接種量在0.0125%～0.025%范圍內，酶活力隨接種量的增加迅速上升至673SU/mL；接種量在0.025%～0.0625%范圍內，酶活力增加變緩，當接種量在0.0625%～0.125%范圍內，盡管接種量翻倍，但酶活力基本不變。

2.4 發(fā)酵時間對酶活力的影響

由圖4可見，當發(fā)酵時間在24～96h內，凝乳酶的活力隨發(fā)酵時間的延長迅速增長，但增加速率逐漸變慢；當發(fā)酵進行到96h時，酶活力達到最大值633SU/mL；96h后，酶活力逐漸降低，隨發(fā)酵時間的延長，降低速率逐漸變慢。

圖4 發(fā)酵時間對凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of fermenting time on the MCE activity

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

基于單因素試驗，全因子中心組合試驗考察的因子為發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質量濃度、裝液量、接種量和發(fā)酵時間對酶活力的影響，各因子的編碼水平分別由A、B、C、D代表(表1)，其中α=1.68。試驗設計及結果見表2，響應值為發(fā)酵液中凝乳酶的活力。

表1 全因子中心組合試驗因素水平及編碼表Table 1 Experimental level and code of variables chosen for Fullfactorial CCD

表1中各因素的編碼值與真實值的關系分別為：A= (X1-40)/2、B=(X2-60)/10、C=(X3-0.125)/0.05、D= (X4-96)/24。

對全因子中心組合設計的試驗結果進行二次多項式擬合得到響應值與各因子的多元回歸方程為：Y=958.83-97.58A-11.89B+20.90C+147.94D-66.09A2-46.989B2-58.4589C2-88.1305D2+46.29AB-3.04AC-28.23AD+ 14.51BC+2.75BD-3.20CD。

表3 回歸方程方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic polynomial model

表2 全因子中心組合試驗設計及結果Table 2 CCD matrix of the four variables with the experimental and predicted MCE activity

通過分析回歸系數(shù)可知影響發(fā)酵產凝乳酶活力的各因素的主次順序為發(fā)酵時間＞葡萄糖質量濃度＞接種量＞裝液量。對上述方程的方差分析見表3，用F檢驗判定回歸方程的顯著性，該模型P＜0.0001，表明該方程極顯著，其校正決定系數(shù)(R2Adj)為0.9996，說明此模型擬合度較高。根據(jù)模型方程繪制的響應曲面圖及其等高線圖見圖5～10。

圖5 葡萄糖質量濃度和裝液量交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.5 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and liquid volume

圖6 葡萄糖質量濃度和接種量交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.6 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and inoculum size

圖7 葡萄糖質量濃度和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.7 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and fermenting time

圖8 裝液量和接種量交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.8 Response surface and their contour plots of MCE activity versus liquid volume and inoculum size

圖9 裝液量和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.9 Response surface and their contour plots of MCE activity versus liquid volume and fermenting time

圖10 接種量和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產凝乳酶活力的響應曲面圖及其等高線Fig.10 Response surface and their contour plots of MCE activity versus inoculum size and fermenting time

由圖5～10可知，葡萄糖質量濃度、裝液量、接種量及發(fā)酵時間對發(fā)酵產凝乳酶活力的影響均較為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡。通過對模型方程及響應面的分析，優(yōu)化得到該菌株發(fā)酵產凝乳酶的最適條件為：葡萄糖質量濃度16.2g/L，500mL三角瓶中裝發(fā)酵液53.3mL，接種量0.130%，發(fā)酵時間120.43h，預測在此條件下酶活力為1097.30SU/mL。經實驗驗證在此條件下發(fā)酵產凝乳酶活力為(1129.05±74.55)SU/mL，與模型預測值相符。

3 討 論

細菌具有體積小、繁殖快、發(fā)酵產物易于提取分離等特點，能在人工控制的條件下進行生產，如能篩選得到高產凝乳酶的細菌，則應用于工業(yè)化生產將有很大的潛力[8]?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵產凝乳酶可以葡萄糖、果糖[9]、蔗糖[10]為碳源，也有研究指出葡萄糖對于擬諾卡氏屬細菌(Nocardiopsis sp.)發(fā)酵產凝乳酶幾乎沒有影響[11]。本菌種在前期實驗中，向培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖和蔗糖，發(fā)酵結束后添加葡萄糖獲得的最高酶活力比蔗糖的高100SU/mL。單因素試驗中葡萄糖質量濃度對凝乳酶活力呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，高質量濃度的葡萄糖可能產生鈍化作用或影響到培養(yǎng)基的營養(yǎng)平衡。裝液量直接影響到發(fā)酵過程中發(fā)酵液中溶解氧的濃度。對于好氧發(fā)酵，菌體處于不同的生長階段其需氧量也不同，溶解氧濃度是提高生產能力的關鍵因素之一[12]。菌體對裝液量的要求反映出發(fā)酵過程中菌體對氧氣的依賴程度，此株枯草芽孢桿菌對溶氧有一定的需求；文獻[12]報道搖瓶中料液體積增加時，體積吸氧速率降低，當裝液量超過10%時，料液體積進一步增加對于體積吸氧速率無大影響[13]，這與裝液量80～100mL/500mL區(qū)間內凝乳酶活力下降速率減慢一致。一般認為，接種量過低將延長菌體的遲滯期，導致菌體的生長減慢，發(fā)酵時間延長，而本實驗中發(fā)現(xiàn)接種量極低的情況下利于產酶，是一個值得關注的現(xiàn)象，目前其具體機理尚不清楚，需要進一步深入研究。有報道表明，發(fā)酵產凝乳酶的最適發(fā)酵時間為3～8d，因不同菌種而異[10]，本株細菌產凝乳酶隨發(fā)酵時間先升后降，變化的情況與淀粉絲菌(Amylomyces rouxii)在米湯培養(yǎng)基中發(fā)酵產凝乳酶[14]的情況相似。

鮮有研究將響應曲面優(yōu)化應用于凝乳酶液態(tài)發(fā)酵生產中，本實驗對一株產凝乳酶能力較強的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，分析發(fā)現(xiàn)3個單因素變量都是影響凝乳酶活力的關鍵因素，所得回歸方程極顯著，模型擬合程度較高，預測酶活力為1097.30SU/mL，實驗驗證得到(1129.05±74.55)SU/mL，與預測值相符，酶活力較優(yōu)化前有顯著提高。

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Optimizing the Fermentation Process for Milk-clotting Enzyme Production by Bacillus subtilis

DING Ming-liang，OUYANG An-ran，WANG Wang-fei，GU Zheng-hua，DING Zhong-yang*，
ZHANG Liang，SHI Gui-yang
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to improve the yield of milk-clotting enzyme (MCE), response surface methodology (RSM) was used to optimize the fermentation process for the production of milk-clotting enzyme from Bacillus subtilis under liquid fermentation. The results showed that the optimal parameters for the fermenting process were as follows: glucose 16.2 g/L, 53.3 mL medium in a 500 mL Erlenmeyer flask, inoculums size 0.130%, fermenting time 120.43 h, and the predicted MCE yield was 1097.30 SU/mL. Under the optimal conditions the MCE activity was (1129.05 ± 74.55) SU/mL, indicating that the optimizing process is effective.

milk-clotting enzyme；Bacillus subtilis；submerged fermentation；response surface methodology；optimization

Q814.4

A

1002-6630(2011)03-0156-05

2010-04-12

丁明亮(1988—)，男，本科生，研究方向為生物化工。E-mail：dingmingliang0918@163.com

*通信作者：丁重陽(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn