金屬離子對木聚糖酶制備阿魏酸糖酯的影響

趙 冰，劉海順，王 靜,，張 可，孫寶國，曹雁平

(1.北京工商大學 北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.中儲糧北京分公司承德糧油質(zhì)檢中心，河北省承德市雙灤區(qū)東平臺，河北 承德 067001；4.空軍航空醫(yī)學研究所，北京 100142)

金屬離子對木聚糖酶制備阿魏酸糖酯的影響

趙 冰1,2，劉海順3，王 靜1,2,*，張 可4，孫寶國1,2，曹雁平1,2

(1.北京工商大學 北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.中儲糧北京分公司承德糧油質(zhì)檢中心，河北省承德市雙灤區(qū)東平臺，河北 承德 067001；4.空軍航空醫(yī)學研究所，北京 100142)

采用木聚糖酶制備小麥麩皮中的阿魏酸糖酯。結果表明：添加金屬離子會明顯影響木聚糖酶的活性，K+、Ca2+、Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+對木聚糖酶有激活作用，其中Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+有較強的激活作用；而EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+對木聚糖酶有抑制作用，而且高濃度的金屬離子也會抑制木聚糖酶的活性。在制備阿魏酸糖酯時添加一定濃度對木聚糖酶有激活作用的金屬離子，可以降低木聚糖酶的添加量。

麥麩；金屬離子；木聚糖酶；阿魏酸糖酯

小麥是世界上最重要的糧食作物，約占世界糧食產(chǎn)量的三分之一[1]，小麥麩皮的主要成分是非淀粉多糖，約占46%[2]，小麥麩皮中含有很多天然活性成分，如低聚糖、膳食纖維、酚酸類物質(zhì)等，其中阿魏酸作為細胞壁中含量最高的酚酸類物質(zhì)，含量可以達到麥麩質(zhì)量的0.4%～0.7%。在自然界中，大部分阿魏酸是以結合態(tài)存在的，對麥麩進行一系列的處理可以得到帶有阿魏酸基團的活性物質(zhì)。

近年來，阿魏酸糖酯(FOs)引起了許多研究人員的興趣，阿魏酸糖酯可以抑制Cu2+誘導人體低密度脂蛋白的過氧化反應[3]、清除自由基，對AAPH損傷人紅細胞的保護[4]，螯合金屬離子，促進雙歧桿菌的生長[5]等作用，是一種非常有應用前景的抗氧化劑。內(nèi)切木聚糖酶酶解小麥麩皮能夠產(chǎn)生阿魏酸糖酯，當不同類型和不同濃度的金屬離子作用于木聚糖酶時，木聚糖酶顯示出不同的活性，進而影響阿魏酸糖酯的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮，粉碎后過40目篩備用。

α-淀粉酶(α-Amylase)、糖化酶 北京奧博興生物技術有限責任公司；堿性蛋白酶(Alcalase) 丹麥諾維信公司；華揚木聚糖酶 武漢新華揚生物有限公司；木聚糖 美國Sig-Ald公司。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木聚糖酶酶活性的測定方法

按照參考文獻[6]測定。

1.3.2 木聚糖酶最適反應參數(shù)的測定

按照參考文獻[6-8]測定。

1.3.2.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

在40～80℃之間測定酶活力，酶活力最高時的溫度的即為酶的最適溫度；將酶在不同的溫度下保溫1h后，迅速流水冷卻至室溫，再測定酶的殘余酶活力，以在30℃條件下保存的酶為標準，其他各組與其進行比較。

1.3.2.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性

使用醋酸鹽緩沖液來研究pH值對木聚糖酶酶活的影響。配制50mmol/L的各種pH值的緩沖液，用不同pH值的緩沖液配制酶和底物，酶活力最高的即為酶的最適pH值；將酶在不同的pH值的緩沖液中室溫下保溫1h后，再測定酶的殘余酶活力，以未保溫的酶為標準，其他各組與其進行比較。

1.3.3 金屬離子對木聚糖酶活性的影響[9-11]

在稀釋好的木聚糖酶溶液中分別加入4mmol/L的KCl、CaCl2、MnCl2、SnCl2、AgNO3、ZnCl2、FeCl2、FeCl3、HgCl2、MgCl2、CoCl2、EDTA，然后將其在30℃保溫30min，迅速冷卻，加入1mL 10mg/mL的木聚糖溶液，然后按照1.3.1節(jié)的方法進行測定，以沒有加金屬離子的酶液作對照。比較它們的活性。通過以上實驗獲得對木聚糖酶有激活作用的金屬離子，然后進一步研究最適宜的金屬離子的濃度，分別配制10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L的對木聚糖酶有激活作用的金屬離子溶液，按照1.3.2節(jié)的方法測定木聚糖酶的酶活力。

1.3.4 加入金屬離子對木聚糖酶制備阿魏酸糖酯的影響

以小麥麩皮為原料制備不溶性膳食纖維[12]，再用木聚糖酶酶解不溶性膳食纖維制備阿魏酸糖酯[13]，以不同濃度的木聚糖酶處理不溶性膳食纖維，比較產(chǎn)生的阿魏酸糖酯的濃度。

實驗分實驗組和對照組。實驗組是Z n2+濃度為20mmol/L的MOPS緩沖液，而對照組僅僅是MOPS緩沖液，分別用兩種溶液配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5g/L的木聚糖酶溶液，料液比1:10，在60℃反應36h，然后測定阿魏酸糖酯的濃度。

阿魏酸糖酯的濃度通過雙波長的方法進行測定[14-16]：在100mmol/L、pH6.0的MOPS緩沖液中，阿魏酸在286nm波長處有最大吸收，阿魏酸糖酯在325nm波長處有最大吸收，在這兩個波長下，它們的摩爾消光系數(shù)分別為：阿魏酸ε286nm=14176L/(mol·cm)和ε＇286nm=12465L/(mol·cm)，阿魏酸糖酯ε325nm=10350L/(mol·cm)和ε＇325nm=19345 L/(mol·cm)。木聚糖酶水解小麥麩皮不溶性膳食纖維產(chǎn)生的阿魏酸糖酯的濃度([FOs])按照下面的公式進行計算。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶酶活的測定及最適反應參數(shù)的確定

圖1 木聚糖酶的酶活性隨溫度的變化Fig.1 Change of xylanase activity with heating temperature

圖2 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Effect of temperature on xylanase stability

圖3 木聚糖酶的酶活性隨pH值的變化Fig.3 Change of xylanase activity with pH values

圖4 木聚糖酶的pH值穩(wěn)定性Fig.4 Effect of pH on xylanase stability

通過測定得到木聚糖酶的酶活為60233.33U。由圖1可知，木聚糖酶的活力在60℃達到最大，在60～70℃之間基本保持不變，從70℃開始急劇下降；由圖2可知，隨著溫度的升高，木聚糖酶的活力逐漸降低，60℃以后急劇下降。因此，可以確定木聚糖酶的最適反應溫度為60℃。由圖3可知，木聚糖酶在pH5.0達到最大，結合圖4木聚糖酶的pH值穩(wěn)定性的結果，可以確定木聚糖酶的最適pH值為5.0。

2.2 金屬離子對木聚糖酶活性的影響

選擇濃度為4mmol/L的各種金屬離子與木聚糖酶作用，在25mL的具塞比色管中分別加入1mL木聚糖酶溶液和1mL金屬離子溶液保溫后測定木聚糖酶的酶活，以不加金屬離子的酶活為100%。

圖5 不同金屬離子對木聚糖酶酶活性的影響Fig.5 Effect of different metal ions on the activity of xylanase

由圖 5 可知，K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+對木聚糖酶有激活作用，而EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、Mg2+對木聚糖酶有不同程度的抑制作用，其中Mn2+、Zn2+、Co2+對木聚糖酶有較高的激活作用，4mmol/L Mn2+可以使木聚糖酶的酶活提高120%以上。為了進一步確定Mn2+、Zn2+、Co2+對木聚糖酶的最適添加濃度，選擇濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L的Mn2+、Zn2+、Co2+溶液，使其與木聚糖酶作用，進一步測定其酶活，以不添加金屬離子的酶活為100%。3種不同濃度的金屬離子對木聚糖酶的作用效果如圖6～8所示。

圖6 不同濃度的Zn2+對木聚糖酶酶活性的影響Fig.6 Effects of Zn2+concentration on the activity of xylanase

由圖6可知，Zn2+的濃度在10～40mmol/L之間時，Zn2+對木聚糖酶的激活作用在一直增加，在40mmol/L達到最大，可以達到對照的170%，而繼續(xù)增加Zn2+的濃度，其又會對木聚糖酶產(chǎn)生抑制作用。

圖7 不同濃度的Mn2+對木聚糖酶酶活性的影響Fig.7 Effects of Mn2+concentration on the activity of xylanase

由圖7可知，Mn2+的濃度在0～20mmol/L之間時，Mn2+對木聚糖酶的激活作用在一直增加，在20mmol/L達到最大，可以達到對照的125%以上，繼續(xù)增加Mn2+的濃度，又會對木聚糖酶產(chǎn)生抑制作用。

圖8 不同濃度的Co2+對木聚糖酶酶活性的影響Fig.8 Effects of Co2+concentration on the activity of xylanase

由圖8可知，對于Co2+來說，它對木聚糖酶的激活作用在較低的濃度就可以達到最高，在0～6mmol/L的濃度范圍內(nèi)，Co2+對木聚糖酶的激活作用一直在增加，在6mmol/L達到最高，可以達到對照的120%左右，但是隨著Co2+濃度的增加又會抑制木聚糖酶的活性，該木聚糖酶對Co2+的耐受強度較低，在達到16mmol/L時木聚糖酶的酶活就只有對照的60%左右。

因此，不同濃度、不同種類的金屬離子對木聚糖酶的影響是不同的，因此需要找到最適宜的金屬離子的濃度。對于抑制的機理可能是：金屬離子能與木聚糖酶活性中心的半胱氨酸殘基上的巰基結合，抑制酶的活性，或者是酶的非活性中心部分與金屬離子結合，使結構發(fā)生變形，使酶活性減弱；對于激活的機理可能是木聚糖酶是金屬酶，而且很多金屬離子有絡合作用，金屬離子更容易維持H+濃度的穩(wěn)定，同時添加金屬離子也可以改變酶所處的緩沖溶液的離子強度。

2.3 加入金屬離子對木聚糖酶制備阿魏酸糖酯的影響

圖9 金屬離子對FOs產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of metal ions on the production of FOs

由圖9可知，添加Zn2+的實驗組木聚糖酶質(zhì)量濃度在0.6g/L時阿魏酸糖酯的含量就可以接近對照組木聚糖酶質(zhì)量濃度為1g/L時阿魏酸糖酯的含量。但是阿魏酸糖酯的最高含量基本上沒有變化，這說明一定濃度的Zn2+僅僅能夠提高木聚糖酶的活性，對于阿魏酸糖酯的產(chǎn)量提高并沒有太大的幫助。

3 結 論

3.1 金屬離子對木聚糖酶的活性有較大的影響：K+、Ca2+、Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+對木聚糖酶有激活作用，而 EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+會抑制木聚糖酶的酶活，其中Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+有較強的激活作用，其中Zn2+的濃度達到40mmol/L時木聚糖酶酶活性達到最高，而且高濃度的金屬離子會抑制木聚糖酶的活性。

3.2 當使用含有金屬離子的木聚糖酶制備阿魏酸糖酯的時候發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為0.6g/L的木聚糖酶添加Zn2+后，魏酸糖酯的含量和1g/L木聚糖酶不添加金屬離子的阿魏酸糖酯的含量，由于木聚糖酶較高的價格使得通過使用金屬離子激活木聚糖酶的活性來減少木聚糖酶的使用量成為可能，在工業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應用前景。

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Influence of Ions on Feruloyl Oligosaccharide Preparation from Wheat Bran by Xylanase Hydrolysis

ZHAO Bing1,2，LIU Hai-shun3，WANG Jing1,2,*，ZHANG Ke4，SUN Bao-guo1,2，CAO Yan-ping1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Plant Resource Research and Development, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048,China；3. Chengde Grain Quality Test Center, China Grain Reserves Corporation Beijing Branch, Shuangluan District, Chengde 067001, China；4. Air Force Institute of Aviation Medicine, Beijing 100142, China)

The feruloyl oligosaccharide was prepared from wheat bran by xylanase. The results indicated that the activity of xylanase was strongly affected by metal ions. K+, Ca2+, Mn2+, Ag+, Zn2+, and Co2+could activate xylanase, and Mn2+, Ag+, Zn2+and Co2+showed stronger promoting effect. The activating effect of Zn2+was positively dependent on its concentration within a certain range, but excessively high concentration inhibited the activity of the enzyme. However, EDTA, Sn2+, Fe2+, Fe3+, Hg2+and Mg2+were inhibitors of the enzyme. Less xylanase was required when adding a certain concentration of metal ions during preparation of feruloyl oligosaccharide.

wheat bran；metal ions；xylanase；feruloyl oligosaccharide

Q814

A

1002-6630(2011)03-0019-04

2010-03-30

北京市教育委員會面上項目(KM200910011002)；北京市科技新星項目(2008B07)

趙冰(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)副產(chǎn)品資源的開發(fā)利用。E-mail：zhaobtg@163.com

*通信作者：王靜(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)副產(chǎn)品資源的開發(fā)利用。E-mail： jwang810@yahoo.com.cn