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    枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

    2012-06-08 03:15:56黃璠蔡俊
    飼料工業(yè) 2012年2期
    關(guān)鍵詞:裝液產(chǎn)酶中性

    黃璠 蔡俊

    在我國,飼用酶制劑的開發(fā)與利用始于20世紀(jì)90年代[1]。多年來,人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶對動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物有著獨(dú)特的作用,目前飼料工業(yè)中應(yīng)用的蛋白酶多為酸性蛋白酶,而不同pH值的蛋白酶對飼料作用的影響正成為飼料行業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn),已有相關(guān)報(bào)道,中性蛋白酶作為飼料添加劑有很好的效果[2-4]。但中性蛋白酶的產(chǎn)量低、成本高等因素限制了其大規(guī)模應(yīng)用[5]。本研究以枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件為研究對象,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn)酶的發(fā)酵條件,取得了很好的效果,為進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 菌種

    枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),本實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化鈉5 g/l、瓊脂 20 g/l、水 1 L,pH 值 7.2~7.4。

    種子培養(yǎng)基:液體斜面培養(yǎng)基。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氫二鈉 4 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、水 1 L,pH 值 7.2。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 初始發(fā)酵條件

    取活化好的斜面菌株,接種一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基(50/250 ml),37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后,以3%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50/250 ml),37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。

    1.2.2 蛋白酶活力測定[6]

    按國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527—2009),采用 Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。

    1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

    1.2.3.1 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

    采用單因素試驗(yàn),分別考察裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。裝液量(250 ml三角瓶中)分別為 30、50、70、90 ml;轉(zhuǎn)速分別取160、180、200和220 r/min;培養(yǎng)基初始pH值分別取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2;發(fā)酵周期分別取24、36、48、60、72 和 84 h;接種量分別取 1%、2%、3%、4%、5%;發(fā)酵溫度分別取33、35、37、39和 41 ℃。

    1.2.3.2 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

    在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取部分影響較大的因素(裝液量、初始pH值、發(fā)酵周期),進(jìn)一步縮小范圍進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同單因素對發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響(見圖1~圖6)

    圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

    由圖1可知,最優(yōu)裝液量為50 ml。此時(shí)(即初始條件下)酶活為36.755 ml,由于裝液量小,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分少,不利于產(chǎn)酶,且資源利用率低。裝液量大,可能對溶氧有一定的影響,枯草芽孢桿菌是好氧菌,也不利于產(chǎn)酶。

    圖2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

    由圖2可知,轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶活最大,此時(shí)酶活為46.988 U/ml,隨著轉(zhuǎn)速的增大,酶活增大,說明轉(zhuǎn)速增大,溶氧增大,有利于產(chǎn)酶;當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí)酶活降低,可能是轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大,對枯草芽孢桿菌本身有損害,從而使酶活降低。

    由圖3可知,最優(yōu)初始pH值為6.7,此時(shí)酶活為78.411 U/ml,pH值繼續(xù)升高,酶活降低,說明弱酸性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶;由圖4可知,最優(yōu)發(fā)酵周期為60 h,此時(shí)酶活為86.987 U/ml;由圖5可知,最優(yōu)接種量為4%,此時(shí)酶活為109.041 U/ml;由圖 6可知,最優(yōu)發(fā)酵溫度為37℃,此時(shí)酶活為120.067 U/ml,溫度過低不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)酶,溫度過高菌體易衰老而影響其正常的生長和代謝。

    圖3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

    圖4 發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響

    圖5 接種量對產(chǎn)酶的影響

    圖6 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

    2.2 部分發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)研究

    由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,裝液量、初始pH值和發(fā)酵周期對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大,進(jìn)一步縮小范圍,采用L9(33)正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見表 2、表 3。

    表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果

    表3 方差分析結(jié)果

    由表2可知,這3種因素對產(chǎn)酶的影響效果不同,其影響程度為:裝液量(ml)>初始pH值>發(fā)酵周期(h),這3種因素對產(chǎn)酶影響都是顯著的,所得的最優(yōu)組合為 A3B3C2,即裝液量 60 ml,初始pH值6.9,發(fā)酵周期60 h,恰好與正交表中的方案9一致,在此發(fā)酵條件下對產(chǎn)酶最有利,最大酶活為151.319 U/ml。

    3 結(jié)論

    通過發(fā)酵條件(裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度)的單因素試驗(yàn)以及裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期的正交試驗(yàn),得到了最優(yōu)發(fā)酵條件為裝液量 60 ml,轉(zhuǎn)速200 r/min,初始pH值6.9,發(fā)酵周期 60 h,接種量4%,發(fā)酵溫度37℃。由正交試驗(yàn)證明了裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期對產(chǎn)酶影響顯著。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化,酶活提高了311.7%。

    [1]Bedford MR.Exogenous enzymes in monogastric nutrition-their current value and future benefits[J].Animal Feed Science and Technology,2000,86:1-13.

    [2]凌寶明,馮定遠(yuǎn),左建軍.飼用蛋白酶的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2009,30(22):7-10.

    [3]陳建明,葉金云,許堯興,等.飼料中添加中性蛋白酶對青魚生長、消化及魚體組成的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2009,33(4):726-731.

    [4]李艷麗,許少春,許堯興.中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶酶系分析[J].生物技術(shù),2007,17(1):20-23.

    [5]孫曉鳴,王萍,鄔向東.產(chǎn)中性蛋白酶芽孢桿菌配伍發(fā)酵響應(yīng)面法研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2):117-124.

    [6]中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)管局.GB/T23527-2009ICS67.220.22X69-2009,蛋白酶制劑[S].北京:標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009.

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