預(yù)消化法酶解飼用海藻粉中非淀粉多糖的初步研究

王昌義 單守水 徐世艾

飼用海藻粉作為一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飼料添加劑，含有豐富的海藻多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)以及具有特殊功效的生理活性物質(zhì)，其糖類含量在40%以上[1]，特別適合在海參等高附加值水產(chǎn)品的飼料中添加。目前，飼用海藻粉的使用還處于初級(jí)階段，在禽類、畜類以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[2-3]的少量應(yīng)用均取得了一定的效果。但是，由于海藻細(xì)胞中的非淀粉多糖（NSPs）如纖維素、半纖維素、β-葡聚糖、果膠等不能被動(dòng)物分泌的內(nèi)源酶降解，產(chǎn)生了食糜黏度增加、營(yíng)養(yǎng)屏障作用和微生物菌群數(shù)量增加等不利影響[4-6]，降低了飼用海藻粉的利用率。解決這一在植物性飼料源使用中普遍存在的問(wèn)題的方法是在飼料加工過(guò)程中添加非淀粉多糖酶[7]來(lái)酶解其中的NSPs，經(jīng)過(guò)與動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶的協(xié)同作用提高飼料養(yǎng)分的消化利用率[8]，但是目前對(duì)于海藻粉中NSPs的酶解研究報(bào)道較少。為了充分發(fā)揮酶制劑對(duì)海藻粉的酶解作用，可以用預(yù)消化[9]的方法酶解NSPs。章世元等[10-11]對(duì)飼料的體外預(yù)消化進(jìn)行了深入的研究，此方法可以避免傳統(tǒng)添加法[12]和后置噴涂法[13]中酶制劑活性降低或者不能充分發(fā)揮作用的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：飼用海藻粉（鼠尾藻粉），購(gòu)于萊州市朱旺海參育苗場(chǎng)，80℃條件下烘干備用；纖維素酶(酶比活力 50000 U/g)、木聚糖酶(酶比活力 50000 U/g)、β-葡聚糖酶(酶比活力25000 U/g)、中溫淀粉酶(酶比活力3000 U/g)，酶制劑均購(gòu)于肇東市酶制劑有限公司。

主要儀器：722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴，江蘇省金華市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.2 分析方法

還原糖含量的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）[14]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶制劑最佳使用量的確定

配置不同酶活力梯度的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶酶液。分別配置10%的海藻粉液20 ml，攪拌均勻后相應(yīng)加入不同酶活力梯度的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶酶液各2.00 ml，混合均勻后于40℃恒溫水浴中酶解60 min。酶解完成后經(jīng)沸水浴滅活、3000 r/min離心、上清液定容后，用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定上清液中還原糖含量。確定纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶的最佳使用量。

1.3.2 酶制劑最適溫度范圍的確定

設(shè)置溫度梯度為 30、40、50、60、70 ℃。按照同樣步驟在不同溫度條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進(jìn)行酶解試驗(yàn)，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適溫度范圍。

1.3.3 酶制劑最適pH值范圍的確定

配置 pH 值梯度為 3、4、5、6、7 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。按同樣步驟在不同pH值條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進(jìn)行酶解試驗(yàn)，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適pH值范圍。

1.3.4 酶制劑最適酶解時(shí)間條件的確定

設(shè)置酶解時(shí)間梯度為 30、60、90、120、150 min。按照同樣步驟在不同酶解時(shí)間條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進(jìn)行酶解試驗(yàn)，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適酶解時(shí)間條件。

1.3.5 4種酶制劑酶解飼用海藻粉的正交試驗(yàn)

為了考查溫度、pH值、酶解時(shí)間等因素間的相互影響以及綜合作用，在確定了4種酶制劑最適酶解溫度范圍、pH值范圍和時(shí)間條件后，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，以確定4種酶制劑最佳使用條件。

1.3.6 3種非淀粉多糖酶的評(píng)價(jià)試驗(yàn)

在獲得了3種非淀粉多糖酶酶解海藻粉中NSPs的最佳使用條件后，為了更好地評(píng)價(jià)3種非淀粉多糖酶的作用能力，應(yīng)在其最佳使用條件下同時(shí)進(jìn)行酶解評(píng)價(jià)試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)比與評(píng)價(jià)可以確定3種非淀粉多糖酶對(duì)海藻粉的酶解能力與酶解效果。

1.3.7 纖維素酶、木聚糖酶與中溫淀粉酶的復(fù)合試驗(yàn)

海藻粉中的NSPs主要有纖維素、半纖維素、葡聚糖等，其中纖維素和半纖維素主要存在于海藻細(xì)胞壁中，而細(xì)胞壁的存在阻礙了淀粉酶對(duì)細(xì)胞壁內(nèi)淀粉的酶解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證纖維素酶和木聚糖酶對(duì)海藻細(xì)胞壁中NSPs的酶解情況，應(yīng)進(jìn)行纖維素酶、木聚糖酶與中溫淀粉酶復(fù)合酶解試驗(yàn)，由于β-葡聚糖在細(xì)胞壁中量很少，不對(duì)其進(jìn)行復(fù)合試驗(yàn)研究。復(fù)合酶解試驗(yàn)條件為：每克海藻粉中添加復(fù)合的各酶活力均為40U，溫度為45℃，pH值為6、酶解時(shí)間為60 min。通過(guò)復(fù)合酶酶解試驗(yàn)與單一酶酶解的對(duì)比試驗(yàn)來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)淀粉是否被利用，從而可以進(jìn)一步證明纖維素酶和木聚糖酶對(duì)海藻細(xì)胞壁中NSPs的酶解效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種酶制劑酶解海藻粉單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶使用量對(duì)4種酶制劑酶解效果的影響 (見(jiàn)圖1)

圖1 酶活力對(duì)還原糖增加量的影響

由圖1可以看出，每克海藻粉中使用纖維素酶在30 U以上時(shí)還原糖的增加量基本不變，說(shuō)明此時(shí)纖維素酶對(duì)底物酶解效果達(dá)到最佳，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益考慮應(yīng)將30 U作為纖維素酶的最佳使用量。同理，每克海藻粉中木聚糖酶最佳使用量為40 U；每克海藻粉中β－葡聚糖酶的最佳使用量為40 U；每克海藻粉中中溫淀粉酶的最佳使用量為40 U。由于后3種酶制劑的最佳使用量均為40 U，為了在接下來(lái)的試驗(yàn)中增強(qiáng)4種酶制劑的對(duì)比，在單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)和對(duì)比復(fù)合試驗(yàn)中每克底物使用4種酶制劑的量均為40 U。

2.1.2 溫度條件對(duì)4種酶制劑酶解效果的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 溫度對(duì)還原糖增加量的影響

由圖2可以看出，纖維素酶在40～50℃之間時(shí)對(duì)海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最適酶解溫度范圍約在35～45℃之間；β－葡聚糖酶最適酶解溫度范圍約在45～55℃之間；中溫淀粉酶的最適酶解溫度范圍在40～50℃之間。

2.1.3 pH值條件對(duì)4種酶制劑酶解效果的影響 (見(jiàn)圖3)

圖3 pH值對(duì)還原糖增加量的影響

由圖3可以看出，纖維素酶pH值范圍約在4.5～6之間時(shí)對(duì)海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最適酶解pH值范圍在5～6之間；β－葡聚糖酶的最適酶解pH值范圍在5～6.5之間；中溫淀粉酶的最適酶解pH值范圍在5.5～6.5之間。

2.1.4 酶解時(shí)間條件對(duì)4種酶制劑酶解效果的影響(見(jiàn)圖4)

圖4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖增加量的影響

由圖4可以看出，纖維素酶、木聚糖酶、β－葡聚糖酶、中溫淀粉酶在酶解時(shí)間達(dá)到60 min后，還原糖增加量基本不再變化。

2.2 4種酶制劑酶解飼用海藻粉的正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)前面4種酶制劑的單因素試驗(yàn)確定了其最適溫度范圍、pH值范圍、酶解時(shí)間條件，為了考查各個(gè)因素之間的綜合效應(yīng)，分別用溫度、pH值、酶解時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)其進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1(表中的空白因素略去)。各個(gè)因素的水平的選擇均在其最適范圍內(nèi)平均劃分。

表1 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

4種酶制劑酶解海藻粉的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，數(shù)據(jù)直觀分析見(jiàn)表3。

表2 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀分析

由表2可知，對(duì)于纖維素酶，由極差分析可知，pH值極差最大，為0.134，其次為溫度，酶解時(shí)間影響較小，其最佳組合為B2A1C2，即pH值為5.5、溫度為40℃、酶解時(shí)間為60 min時(shí)酶解效果最好，為其最佳使用條件；對(duì)于木聚糖酶，由極差分析可知，pH值極差也是最大，為0.843，其次為溫度、酶解時(shí)間，其最佳組合為B3A3C1，即pH值為6、溫度為45℃、酶解時(shí)間為40min時(shí)酶解效果最好，為其最佳使用條件；對(duì)于β-葡聚糖酶，由極差分析可知，溫度極差最大，為0.624，其次為酶解時(shí)間和pH值，其最佳組合為A2C2B3，即溫度為50℃、酶解時(shí)間為60 min、pH值為6時(shí)酶解效果最好，為其最佳使用條件；對(duì)于中溫淀粉酶，由極差分析可知，pH值極差最大，為0.527，其次為酶解時(shí)間、溫度，其最佳組合為B2C2A1，即pH值為6、酶解時(shí)間為60 min、溫度為45℃時(shí)酶解效果最好，為其最佳使用條件。

2.3 評(píng)價(jià)試驗(yàn)與復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖5)

評(píng)價(jià)試驗(yàn)為A、B、C號(hào)試驗(yàn)，同時(shí)在3種非淀粉多糖酶的最佳使用條件下進(jìn)行，由圖5可以看出，β-葡聚糖酶對(duì)海藻粉的酶解能力較好，還原糖增加率達(dá)到19.0%，纖維素酶和木聚糖酶的酶解能力相近，還原糖增加率均為10%左右，這一點(diǎn)與海藻細(xì)胞壁中纖維素與半纖維素含量相近一致。通過(guò)評(píng)價(jià)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)：3種非淀粉性多糖酶對(duì)飼用海藻粉中的NSPs有一定酶解效果，可使其中的部分NSPs轉(zhuǎn)化為可被動(dòng)物吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)——還原糖。

復(fù)合試驗(yàn)為 E、F、G號(hào)試驗(yàn)，其中A、B、C、D號(hào)試驗(yàn)為其對(duì)比。

圖5 4種酶制劑酶解海藻粉評(píng)價(jià)與復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可以看出，E試驗(yàn)中還原糖增加量與還原糖增加率分別為1.754 mg/g和29.6%，高于A試驗(yàn)和D試驗(yàn)中還原糖增加量之和1.261 mg/g及還原糖增加率之和21.3%；F試驗(yàn)的還原糖增加量與還原糖增加率分別為1.543 mg/g和26.1%，也高于B試驗(yàn)和D試驗(yàn)中還原糖增加量之和1.310 mg/g及還原糖增加率之和22.1%。在G試驗(yàn)中，還原糖增加量與還原糖增加率分別達(dá)到3.013 mg/g和50.9%，較A試驗(yàn)、B試驗(yàn)和D試驗(yàn)中的還原糖增加量之和1.954 mg/g及還原糖增加率之和33.0%分別提高了1.059 mg/g和17.9個(gè)百分點(diǎn)。這說(shuō)明，纖維素酶和木聚糖酶對(duì)海藻細(xì)胞壁進(jìn)行了較好的酶解，細(xì)胞內(nèi)的淀粉類物質(zhì)部分被中溫淀粉酶酶解。另外，G試驗(yàn)中還原糖增加量3.013 mg/g與還原糖增加率50.9%既高于B試驗(yàn)和E試驗(yàn)中還原糖增加量之和2.447 mg/g及還原糖增加率之和41.3%，也高于A試驗(yàn)和F試驗(yàn)中還原糖增加量之和2.187 mg/g及還原糖增加率之和37.0%，這表明纖維素酶與木聚糖酶共同使用時(shí)效果好于其單獨(dú)使用。

3 結(jié)論

本文以預(yù)消化的方法研究了纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶和中溫淀粉酶對(duì)飼用海藻粉中NSPs的酶解情況。通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定了4種酶制劑酶解的最佳使用條件。通過(guò)評(píng)價(jià)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種非淀粉多糖酶在其最佳使用條件下對(duì)海藻粉中的NSPs均有較好的酶解效果。通過(guò)復(fù)合試驗(yàn)證明纖維素酶和木聚糖可以有效地酶解細(xì)胞壁中的NSPs，其中纖維素酶、木聚糖酶和中溫淀粉酶復(fù)合試驗(yàn)比單一酶試驗(yàn)還原糖增加量之和及還原糖增加率之和分別提高了1.059 mg/g和17.9個(gè)百分點(diǎn)。

研究表明：非淀粉多糖酶對(duì)飼用海藻粉中的NSPs進(jìn)行了有效酶解，增加了其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，可以提高飼用海藻粉利用率。

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